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Sep 01, 2023

Analyse des protéines critiques

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 350 (2023) Citer cet article

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Ces dernières années, l'émergence du syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus 2 (SRAS-CoV-2), en tant que cause de la pandémie mondiale de la maladie à coronavirus (COVID-19), et de ses variantes, en particulier celles présentant une transmissibilité plus élevée et une évasion immunitaire substantielle, ont mis en évidence l'impératif de développer de nouvelles thérapies comme solutions durables autres que la vaccination pour combattre les coronavirus (CoV). Outre la reconnaissance des récepteurs et l'entrée du virus, les membres du complexe de réplication/transcription SARS-CoV-2 sont des cibles prometteuses pour la conception d'antiviraux. Ici, les résidus d'interaction qui interviennent dans les interactions protéine-protéine (PPI) de nsp10 avec nsp16 et nsp14 ont été analysés de manière approfondie, et les cartes d'interaction, les énergies d'interaction, les réseaux structurels et la dynamique des principaux résidus ont été étudiés. Nsp10 stimule à la fois l'exoribonucléase de nsp14 (ExoN) et la 2'O-méthyltransférase de nsp16 (2'O-MTase). Nsp14 ExoN est une enzyme de relecture d'ARN qui prend en charge la fidélité de la réplication. La Nsp16 2'O-MTase est responsable de l'achèvement du coiffage de l'ARN pour assurer une réplication et une traduction efficaces et s'échapper du système immunitaire inné de la cellule hôte. Les résultats de l'analyse des IPP ont proposé des informations cruciales ayant des implications pour la conception de médicaments antiviraux contre le SRAS-CoV-2. Sur la base des interfaces protéine-protéine partagées prédites des interactions nsp16-nsp10 et nsp14-nsp10, un ensemble d'inhibiteurs peptidiques à double cible a été conçu. Les peptides conçus ont été évalués par amarrage moléculaire, analyse de l'interaction peptide-protéine et calculs d'énergie libre, puis optimisés par mutagenèse à saturation in silico. Sur la base de la conservation évolutive prévue des résidus cibles interagissant entre les CoV, les peptides conçus ont le potentiel d'être développés en tant qu'inhibiteurs de pan-coronavirus à double cible.

La nouvelle maladie à coronavirus humain 2019 (COVID-19), résultant de l'infection par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2)1, a causé un grand nombre de décès confirmés dans le monde et une crise économique mondiale ces dernières années. Le SRAS-CoV-2 est un bêtacoronavirus sphérique enveloppé appartenant à la famille des virus à ARN Coronaviridae2. Le génome du SRAS-CoV-2 partage une identité de séquence de 96,2 %, 79 % et 50 % avec le coronavirus de chauve-souris, le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV) et le coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV), respectivement. L'émergence du SRAS-CoV-2 puis de ses variantes, notamment les variantes préoccupantes (VOC), ainsi que les urgences antérieures du SARS-CoV en 2002-2003 avec 8096 cas et 774 décès (~ 10% de létalité) et du MERS-CoV en 2012 avec 1728 cas confirmés et 624 décès (~ 36% de létalité)3 ont prouvé que les coronavirus (CoV) menace majeure pour l'homme. La pathogénicité des autres CoV humains qui causent le rhume doit également être prise en compte, en particulier chez les nourrissons et les enfants4. L'entrée accélérée dans la cellule hôte du SRAS-CoV-2 comparable à d'autres CoV5, et l'avènement de la variante Omicron (B.1.1.529) avec une transmissibilité plus élevée (3,2 fois supérieure à Delta) et une évasion immunitaire substantielle6, ainsi que ses récentes sous-lignées émergentes, comme BA.4 et BA.5, l'efficacité des vaccins existants a été diminuée, favorisant ainsi les réinfections et l'évasion vaccinale7. Par conséquent, les premiers vaccins et thérapeutiques COVID-19 ne pouvaient pas être des solutions prolongées. Ainsi, en plus de développer des technologies de diagnostic et de surveillance du SRAS-CoV-28,9,10, il est impératif de développer de nouvelles thérapies pour combattre les CoV en tant que solutions durables.

Les cadres de lecture ouverts (ORF) 1a/b sont les plus grands ORF du génome du SRAS-CoV-2. Ces ORF sont situés à l'extrémité 5 'du génome et codent pour deux très grands précurseurs de polyprotéines de réplicase, pp1a et pp1ab, qui sont clivés après la traduction par des protéases virales en 16 protéines non structurelles (nsps)11 (Fig. S1). Nsp12, nsp13, nsp16, nsp14, nsp10, nsp7 et nsp8 sont des membres essentiels du complexe de réplication et de transcription (RTC) du SRAS-CoV-2, qui est responsable de la survie, de l'évolution et de la propagation virales. RTC favorise la réplication, la transcription, la relecture et le coiffage de l'ARN par l'assemblage complexe d'interactions nsp-nsp et nsp-ARN viral11,12,13,14.

Un processus de co-transcription conservé au cours de l'évolution dans le noyau de toutes les cellules eucaryotes assure la modification de l'extrémité 5 'des ARNm naissants avec une coiffe. Le capuchon d'ARNm agit comme un groupe moléculaire conservateur contre le clivage par exonucléase, stabilise les molécules d'ARN, assure un transport nucléocytoplasmique efficace, une traduction vigoureuse des protéines dépendant du capuchon et un traitement pré-ARNm, et empêche également la distinction des ARN non-automatiques lors de la réponse immunitaire innée15,16. Le coiffage des ARN a été détourné par des virus pour surmonter les réponses du système immunitaire de l'hôte par divers mécanismes. Les membres des Coronaviridae ont développé leur propre processus de coiffage spécifique17. Le mécanisme de coiffage du SRAS-CoV-2 consiste en quatre étapes exécutées par une série de nsps, y compris nsp13 sous forme d'ARN 5' triphosphatase (RTPase), une guanylyltransférase (GTase) inconnue, le C-terminal de nsp14 pour l'activité N7-guanine-méthyltransférase (N7-MTase), et nsp16 et son cofacteur critique nsp10 pour la 2'O-méthyltransférase (2'O -MTase)12,18,19 (Fig. 1b).

Représentation schématique du complexe de réplication et de transcription SAR-CoV-2 (RTC) et de son processus de coiffage de l'ARNm. (a) Les principaux membres du RTC du SARS-CoV-2 comprennent l'ARN polymérase dépendante de l'ARN (RdRp ; nsp12), une protéine multifonctionnelle avec des activités d'hélicase et d'ARN 5' triphosphatase (Hel-RTPase ; nsp13), les enzymes méthyltransférases (MTase ; nsp16 et le C-terminal de nsp14), l'exoribonucléase (ExoN ; le N-terminal de nsp14) et nsp10 comme activateur critique pour activer à la fois nsp14 ExoN et nsp16 MTase. (b) Les étapes du processus de coiffage de l'ARNm du SARS-CoV-2 : premièrement, la liaison interphosphate à l'extrémité 5′ de l'ARN triphosphorylé naissant (pppN) est hydrolysée par nsp13 sous forme de RTPase, formant l'extrémité du transcrit diphosphate 5′-ppN. Deuxièmement, la guanosine triphosphate (GTP) est clivée en guanosine monophosphate (GMP) par une guanylyltransférase inconnue (GTase) et transférée à l'ARNm du 5′-diphosphate pour produire GpppN. Troisièmement, la structure cap-0 (7mGpppN) est formée par nsp14 N7-guanine-méthyltransférase (N7-MTase) en présence de S-adénosylméthionine (SAM). Enfin, la structure cap-1 est produite par le complexe nsp16-nsp10 à activité 2'O-méthyltransférase (2'O-MTase).

L'étude des membres du RTC et, en particulier, des interactions protéine-protéine (IPP) des nsps peut être un moyen productif de concevoir des inhibiteurs interférents prometteurs pour les CoV, en particulier après l'entrée du virus dans les cellules hôtes. Le rôle vital des IPP dans presque tous les processus biologiques les rend de plus en plus attractifs pour les approches thérapeutiques20. Récemment, les peptides interférents (IP) ont été plus communément reconnus21, et certains peptides thérapeutiques qui ciblent les IPP ont été approuvés par la Food and Drug Administration (FDA)22 des États-Unis. Plusieurs études ont démontré la puissance des peptides dérivés pour inhiber les IPP dans les CoV23,24,25,26,27. De plus, des données cliniques et des approches informatiques ont proposé des vaccins SARS-CoV-2 nsps en tant que peptides immunodominants capables de conférer une immunité globale contre le COVID-1928.

Nous avons récemment étudié le schéma de liaison protéine-protéine de l'entrée du SARS-CoV-229. L'objectif global de l'étude actuelle était de faire la lumière sur les interactions de nsp10, en tant qu'activateur commun avec nsp16 coiffant la MTase et nsp14 ExoN dans le SARS-CoV-2 RTC, puis de concevoir des inhibiteurs peptidiques pour cibler ces IPP critiques (Fig. S2). Initialement, les résidus d'interaction critiques impliqués dans ces PPI ont été étudiés puis analysés du point de vue de la décomposition de l'énergie libre, des cartes et des énergies d'interaction, des réseaux structurels et de la dynamique moléculaire (Fig. S3). Ces analyses complètes fournissent une image complète des résidus critiques qui sont d'une importance primordiale pour la médiation des mécanismes de plafonnement et de relecture dans le SRAS-CoV-2. Ces résidus clés servent de résidus médicamenteux, avec des implications pour la conception de médicaments contre le SRAS-CoV-2. Ensuite, selon les résultats obtenus, un ensemble de peptides inhibiteurs à double cible a été conçu sur la base des interfaces protéine-protéine partagées prédites des interactions nsp16-nsp10 et nsp14-nsp10. Ainsi, ces peptides ouvrent une nouvelle voie pour perturber simultanément les machines de coiffage et de relecture de l'ARN du SRAS-CoV-2, avec le potentiel d'inhiber l'évasion virale de la reconnaissance immunitaire de l'hôte, d'augmenter le taux de mutation et, par conséquent, d'entraîner des effets létaux sur le SRAS-CoV-2. La conservation évolutive prévue sur le large spectre des CoV pour les résidus cibles qui ont interagi avec les peptides conçus indique la grande puissance des peptides conçus à développer en tant que nouveaux antiviraux pan-coronavirus pour les épidémies actuelles ou futures possibles liées aux CoV.

La Protein Data Bank (rcsb.org/)30 a été utilisée pour obtenir les structures complexes nsp16-nsp10 du SARS-CoV-2 (PDB ID 6W75)31, du SARS-CoV (PDB ID 2XYQ)32, du MERS-CoV (PDB ID 5YNB) et du HCoV-OC43 (PDB ID 7NH7)33. La structure du complexe SARS-CoV-2 nsp14-nsp10 a été modélisée en sélectionnant le complexe SARS-CoV nsp14-nsp10 (PDB ID 5C8S)14 comme modèle à l'aide de SWISS-MODEL34.

Les résidus aux interfaces des complexes protéine-protéine étudiés ont été prédits à l'aide de trois outils in silico, notamment PPCheck 35, le service PISA (Protein Interfaces, Surfaces and Assemblies) de l'Institut européen de bioinformatique (http://www.ebi.ac.uk/pdbe/prot_int/pistart.html)36 et ISPRED437. Ensuite, les résidus de points chauds ont été prédits à l'aide de KFC2 (Knowledge-based FADE and Contacts)38, DrugScorePPI39 et Robetta40. Pour améliorer la précision des résultats, une combinaison d'outils a été utilisée pour identifier les interfaces protéine-protéine et les points chauds. Un résidu était considéré comme un résidu clé (interface et/ou hotspot) s'il était présent au moins dans les résultats de deux des trois outils. De plus, pour une analyse comparative, l'interface des IPP et les résidus de points chauds du complexe nsp16-nsp10 du SRAS-CoV, du MERS-CoV et du HCoV-OC43 ont également été prédits sur la base de l'approche ci-dessus. Les résidus clés ont été cartographiés sur les structures des protéines par UCSF Chimera41. Le tracé de la structure secondaire des deux complexes a été prédit à l'aide de PDBsum42. Ensuite, une analyse computationnelle de l'alanine (CAS) des résidus d'interaction clés prédits des complexes SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 et nsp14-nsp10 a été réalisée par le mCSM-PPI2 (http://biosig.unimelb.edu.au/mcsm_ppi2/), et l'impact de chaque mutation a été évalué en prédisant la différence d'affinités de liaison protéine-protéine entre le type sauvage et le mutant, qui est défini comme ΔΔGAffinité (ΔΔG = ΔGMutant − ΔGtype sauvage)43. De plus, les interactions entre les résidus de type sauvage et mutant avec l'affinité ΔΔGA la plus négative et leurs résidus voisins ont été analysées. Ensuite, une analyse de la décomposition de l'énergie libre par résidu par des calculs de la surface de naissance généralisée de la mécanique moléculaire (MM-GBSA) a été effectuée par le serveur HawkDock (cadd.zju.edu.cn/hawkdock)44 pour les complexes SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 et nsp14-nsp10.

Les interactions des résidus ont été analysées et affichées sur des cartes 2D en utilisant DIMPLOT de Ligplot+45. En outre, le serveur Protein Interactions Calculator (PIC) (pic.mbu.iisc.ernet.in)46 a été utilisé pour analyser différents types d'interactions. De plus, COCOMAPS (molnac.unisa.it/BioTools/cocomaps)47 a été utilisé pour analyser les interfaces PPI étudiées à une distance de coupure de 8 Å en fournissant les cartes de contact de distance et de propriété. De plus, les surfaces accessibles des ensembles ont été prédites par COCOMAPS. De plus, les énergies d'interaction (IE) entre les résidus ont été prédites par le serveur Web Amino Acid Interactions (INTAA) (bioinfo.uochb.cas.cz/INTAA/)48 à l'aide du champ de force AMBER parm99, de l'environnement semblable à l'eau (OBC-II) et du mode d'ajout d'hydrogène. Les cartes thermiques ont été générées à l'aide de THE Heatmapper49. Toute la procédure a été réalisée pour les complexes SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 et nsp14-nsp10.

Le serveur NAPS (Network Analysis of Protein Structures) (bioinf.iiit.ac.in/NAPS/index.php)50 a été utilisé pour l'analyse structurelle du réseau des complexes SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 et nsp14-nsp10. Les paramètres de centralité des nœuds, y compris la centralité de degré (DC), la centralité intermédiaire (BC) et la centralité de proximité (CC) des résidus dans le réseau, ont été prédits en sélectionnant le type de réseau non pondéré C-alpha avec un seuil supérieur de 7 Å dans le mode complexe protéique de NAPS.

Des simulations de dynamique moléculaire (MD) des complexes nsp14-nsp10, nsp16-nsp10, ainsi que des protéines nsp14, nsp16 et nsp10 ont été réalisées par le package AMBER1451 en utilisant le champ de force ff14SB52. Les systèmes ont été solvatés par le modèle explicite d'eau TIP3P dans une boîte octaédrique tronquée à une couche d'hydratation de 12 Å en utilisant xleap. Cinq ions chlorure ont été ajoutés pour neutraliser les systèmes. Toutes les liaisons covalentes pour les atomes d'hydrogène ont été ajoutées aux systèmes à l'aide de l'algorithme SHAKE53. Les interactions électrostatiques ont été calculées à l'aide de l'algorithme PME (Particle Mesh Ewald)54 avec un seuil de 10 Å pour les interactions potentielles de Lennard-Jones dans des conditions aux limites périodiques. L'étape de minimisation a été effectuée pour éliminer les contacts à haute énergie en utilisant respectivement 2000 étapes de la descente la plus raide et 3000 étapes de la méthode du gradient conjugué. Chaque système a ensuite été complètement chauffé de 0 à 300 K sur 400 ps dans un volume constant. L'équilibre des systèmes a été réalisé dans les conditions de pression et de température constantes pendant 1 ns. Après équilibrage, les simulations ont été réalisées à l'aide de pmemd sur une période de 100 ns. L'algorithme de Langevin55 a été utilisé pour contrôler la température dans les simulations. Enfin, les trajectoires ont été analysées à l'aide de cpptraj56. XMGRACE57 a été utilisé pour générer des tracés de l'écart quadratique moyen (RMSD) et de la fluctuation quadratique moyenne (RMSF).

Dans cette étude, les peptides inhibiteurs ont été conçus sur la base de deux méthodologies. Dans la première approche, les peptides inhibiteurs ont été conçus manuellement sur la base des résidus interagissant superposés prédits de nsp10, qui interagissent avec nsp16 et nsp14 dans le SRAS-CoV-2. Dans la deuxième approche, les IPP aux interfaces des complexes SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 et nsp14-nsp10 ont été analysés individuellement à l'aide du serveur Peptiderive58 pour concevoir des inhibiteurs peptidiques ciblant nsp16/nsp14. Peptiderive a systématiquement séparé les peptides de nsp10 avec une fenêtre glissante (avec 5 à 15 longueurs à chaque étape de prédiction), puis a évalué les contributions de ces peptides isolés à l'interaction globale.

Dans la première étape, l'amarrage moléculaire a été effectué à l'aide du serveur HPEPDOCK (http://huanglab.phys.hust.edu.cn/hpepdock/)59 pour l'amarrage local des peptides conçus avec leur(s) cible(s) respective(s). Les résidus du site de liaison de la cible ont été spécifiés en tant que référence sur la base des résidus d'interaction clés prédits par la cible. Les meilleurs critères de sélection de modèles parmi les 10 meilleurs modèles prédits pour chaque complexe peptide-cible étaient les suivants : (i) le modèle qui était lié aux résidus clés de la cible avec une pose similaire par rapport à l'interaction de référence, et interagissait avec plus de résidus clés de la cible ; (ii) le modèle avec une RMSD relativement faible parmi tous les modèles prédits, qui a été examiné par superposition avec la structure de référence ; et (iii) le modèle avec le score d'énergie d'amarrage le plus bas. Chaque modèle du complexe peptide-protéine a été analysé à l'aide de DIMPLOT45 et UCSF Chimera41. Sur la base des résultats HPEPDOCK, les meilleurs peptides ont été soumis à une analyse d'amarrage plus poussée. Ensuite, les structures 3D des peptides sélectionnés ont été modélisées à l'aide de MODPEP (http://huanglab.phys.hust.edu.cn/modpep/)60. Le meilleur modèle a été choisi, et cette étape a été suivie d'un amarrage peptide-protéine à l'aide de HADDOCK 2.461. Les résidus d'interaction clés prédits des étapes précédentes ont été spécifiés comme des résidus actifs, qui étaient directement impliqués dans l'interaction peptide-protéine, et tous les résidus de surface environnants dans le rayon de 6, 5 Å autour des résidus actifs ont été définis comme des résidus passifs. Il convient de noter que le domaine ExoN de nsp14 a été utilisé pour l'amarrage moléculaire. Ici, les mêmes critères de sélection du meilleur modèle ont été utilisés que dans l'étape précédente. L'énergie libre de liaison (ΔG) et la constante de dissociation (Kd) du meilleur complexe du peptide-cible conçu obtenu par la deuxième étape d'amarrage ont été prédites à l'aide de Prodigy (wenmr.science.uu.nl/prodigy)62. De plus, les calculs MM-GBSA utilisant le champ de force ff02, 2000 cycles de descente la plus raide et 3000 cycles de minimisations de gradient conjugué dans le HawkDock (cadd.zju.edu.cn/hawkDock)44 ont été utilisés pour calculer les énergies libres de liaison des complexes peptide-protéine et les décomposer en contributions par résidu.

La méthode MM-PBSA63 a été utilisée pour estimer l'énergie libre de liaison (ΔGbinding) des meilleurs peptides conçus pour leurs cibles respectives. Pendant 50 ns, des simulations MD des meilleurs complexes peptide-protéine ont été réalisées avec AMBER1451. Ensuite, 200 instantanés de complexes peptide-protéine ont été extraits de la trajectoire à différents pas de temps pour calculer les valeurs moyennes de ΔGbinding par mmpbsa.py64.

Les peptides conçus avec les meilleurs scores ont été optimisés à l'aide d'une analyse de mutagenèse à saturation in silico en mutant chaque résidu des peptides conçus en tant que séquences principales des 19 autres acides aminés pour générer une nouvelle bibliothèque de peptides. Ensuite, le changement d'affinité de liaison du nouveau peptide-cible mutant par rapport au complexe peptide-cible principal (ΔΔGAffinity) et l'impact de chaque mutation sur l'affinité de liaison peptide-cible ont été prédits à l'aide de mCSM-PPI243. Pour évaluer plus en détail les peptides conçus, leurs propriétés générales, y compris le poids moléculaire, le point isoélectrique et la charge nette à pH 7, ont été calculées à l'aide du Pep-CaLc65. En outre, les propriétés pharmacocinétiques des peptides conçus ont été prédites par pkCSM (http://biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/)66. La concentration inhibitrice à moitié maximale (IC50) des peptides conçus a été prédite par l'AVP-IC50Pred (crdd.osdd.net/servers/ic50avp/) en utilisant la technique d'apprentissage automatique Random Forest (RFs)67. L'allergénicité et la toxicité des peptides ont été prédites par AllergenFP v.1.068 et ToxinPred69, respectivement. Les complexes protéine-peptide cibles ont été simulés à l'aide de CABS-flex 2.0 (biocomp.chem.uw.edu.pl/CABSflex2/index)70 avec des paramètres par défaut pour analyser les fluctuations des résidus et générer les parcelles RMSF.

Des alignements de séquences multiples des séquences nsp10, nsp16 et nsp14 de sept CoV humains, dont le SRAS-CoV-2, le SRAS-CoV, le MERS-CoV, le HCoV-OC43, le HCoV-HKU1, le HCoV-NL63 et le HCoV-229E, ont été réalisés à l'aide de MultAlin71. ESPrip a été utilisé pour restituer les séquences72. Pour explorer les résidus évolutifs conservés des protéines nsp10 et nsp16 dans toutes les structures rapportées du complexe nsp16-nsp10, y compris SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV et HCoV-OC43, le serveur Web ConSurf (consurf.tau.ac.il/)73 a été utilisé sur la base de la méthode bayésienne. En outre, la conservation des acides aminés du modèle de protéine SARS-CoV-2 nsp14 a été analysée.

Dans cette étude, tout d'abord, les résidus clés à l'interface des complexes protéine-protéine médiant les IPP ont été prédits. Une description du flux de travail de cette étude est présentée à la Fig. S3. L'interface protéine-protéine prédite finale et les résidus de points chauds des complexes SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 et nsp14-nsp10 sont répertoriés dans le tableau 1. Les principaux résidus d'interaction prédits à l'aide de chaque outil sont répertoriés dans les tableaux S1. Pour le complexe nsp16-nsp10, 33 résidus ont été prédits comme résidus d'interface nsp16 et 26 résidus ont été prédits comme résidus d'interface nsp10. V42, K43, M44, L45 et Y96 de nsp10 et I40, M41, V44, T48, V78, V84, Q87, V104 et D106 de nsp16 ont été prédits comme résidus de points chauds pour le complexe nsp16-nsp10. Pour le complexe nsp14-nsp10, 106 résidus ont été identifiés à l'interface protéine-protéine, 45 et 61 résidus aux interfaces de nsp14 et nsp10, respectivement. T5, E6, N10, S11, L14, S15, F16, F19, V21, N40, V42, M44, S72, R78, C79, H80, F89, K93 et ​​Y96 ont été prédits comme des points chauds nsp10 dans le complexe nsp14-nsp10. Les principaux résidus d'interaction pour les deux complexes ont été cartographiés sur leurs structures (Fig. 2a, b). En outre, les tracés de la structure secondaire des complexes SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 et nsp14-nsp10 sont présentés respectivement sur les figures S4 et S5.

Analyse des interfaces protéine-protéine SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 et nsp14-nsp10 et des résidus de points chauds. ( a ) Les interfaces et les points chauds ont été cartographiés sur la structure nsp16-nsp10 aux interfaces protéine-protéine de nsp16 (gris) et nsp10 (cyan), qui sont respectivement colorées en orange et en rouge. ( b ) Les interfaces et les points chauds aux interfaces protéine-protéine de nsp14 (magenta) et nsp10 (cyan) sont respectivement colorés en jaune et en rouge. Les résidus de points chauds sont indiqués par des étiquettes rouges. ( c ) L'interface clé qui se chevauche (violet) et les résidus de point chaud (rouge) de nsp10 (cyan), qui ont interagi avec les protéines nsp16 et nsp14.

Notamment, parmi les principaux résidus interagissant de nsp10, 24 résidus d'interface et trois résidus de points chauds ont été partagés entre les deux complexes dans SAR-CoV-2. Ces résidus clés de nsp10 ont interagi à la fois avec nsp16 (coiffage 2'O-MTase) et nsp14 (relecture ExoN). Les résidus d'interface communs chevauchants de nsp10 dans ces deux complexes étaient T39, N40, C41, V42, K43, M44, L45, C46, ​​T47, V57, T58, P59, G69, G70, A71, S72, C77, R78, C79, H80, K93, G94, K95 et Y96. Les points chauds communs étaient V42, M44 et Y96 (Fig. 2c). De plus, l'analyse des résidus interfaciaux et des points chauds des IPP a indiqué les interactions entre les résidus dans la boucle N-terminale et l'hélice H1 du domaine nsp10 et nsp14 ExoN. De plus, pour élucider les similitudes et les différences dans les interactions de nsp10 avec nsp16 parmi les CoV, les interfaces protéine-protéine et les points chauds du complexe nsp16-nsp10 dans le SRAS-CoV, le MERS-CoV et le HCoV-OC43 ont également été prédits en appliquant la même approche (tableau S1). Les résidus, y compris V42, K43, M44 et L45, étaient des points chauds communs de nsp10 dans tous ces CoV. Les différences résidaient dans T47, R78 et Y96 de nsp10 dans le SRAS-CoV ; K58, H80 et F96 de nsp10 dans le MERS-CoV ; et N40, C41, C46, ​​D47, V57, K58, S72, C77, R78, H80, L89, C90, R93, K95 et F96 de nsp10 dans HCoV-OC43. V84, Q87, V104 et D106 étaient les points chauds partagés de nsp16 parmi ces CoV (Figs. S6 à S8).

Ensuite, les résidus d'interaction clés prédits ont été analysés par CAS à l'aide de mCSM-PPI2. Au total, 153 mutations ont été analysées pour prédire l'impact de la substitution d'alanine sur l'affinité de la liaison protéine-protéine (tableau S2). Comme le montre la figure S9, les mutations, comprenant respectivement Y96A, L45A, V42A, M44A et G70A de nsp10 ; V84A, D106A, V44A, I40A et R86A de nsp16 dans le complexe nsp16-nsp10 ; F16A, Y96A, H80A, E6A et F19A de nsp10, et F8A, P24A, F60A, Q22A et D10A de nsp14 dans le complexe nsp14-nsp10 ; ont montré l'affinité ΔΔGA la plus négative, avec les plus grands impacts décroissants sur les affinités de liaison nsp16-nsp10 et nsp14-nsp10. Ces résultats ont révélé le rôle critique de ces résidus dans la médiation des IPP. Tous ces résidus, à l'exception de G70 de nsp10, R86 de nsp16 et P24 de nsp14, ont été prédits comme points chauds à l'étape précédente. Cependant, des mutations, notamment T49A, V57A et C79A de nsp10, et T91A, G92A et S248A de nsp16 dans le complexe nsp16-nsp10, P8A, S33A, V57A et C79A de nsp10, et T21A, C39A et K47A de nsp14 dans le complexe nsp14-nsp10, ont montré de petites valeurs positives de ΔΔGAffinity (< 1,3 kcal/mol), indiquant la moindre importance de tels résidus pour la formation de complexes. Les interactions entre les résidus de type sauvage et mutant avec l'affinité ΔΔGA la plus négative et leurs résidus voisins sont montrées sur les Fig. S10–S13. De plus, les résultats de l'analyse de la décomposition de l'énergie libre par résidu à l'aide de la méthode MM-GBSA pour les complexes nsp16-nsp10 et nsp14-nsp10 sont présentés dans le tableau S3. Ces résultats ont indiqué que les principaux résidus d'interaction contribuaient de manière significative à l'énergie libre de liaison des IPP par rapport aux autres résidus. Les énergies libres de liaison estimées les plus basses de L45, V42 et M44 de nsp10 et Q87, I40 et V104 de nsp16 dans le complexe nsp16-nsp10 ; et F19, V21 et H80 de nsp10, et N130, H26 et I201 de nsp14 dans le complexe nsp14-nsp10 ont indiqué leurs plus grandes contributions dans ces deux IPP, respectivement. Les résultats du MM-GBSA étaient cohérents avec la prédiction du point chaud et les résultats du CAS ; cependant, le N130 de nsp14 n'a pas été prédit comme point chaud à l'étape précédente.

Selon l'analyse des cartes 2D des interactions résidu-résidu dans le complexe SARS-CoV-2 nsp16-nsp10, les interactions hydrophobes étaient les interactions les plus abondantes (Fig. S14a). N40, V42, K43, M44, L45, P59, A71, K93 et ​​Y96 de nsp10 ont contribué à plusieurs interactions hydrophobes avec les résidus nsp16. De plus, K43, L45, A71, K93, G94 et Y96 de nsp10 ont formé des liaisons H avec les résidus de nsp16. A71 et G94 de nsp10 ont participé aux liaisons H avec D106 de nsp16. De plus, K43, L45, K93 et ​​Y96 de nsp10 ont formé des liaisons H avec K38, Q87, S105 et A83 de nsp16, respectivement. L'analyse de l'interaction nsp16-nsp10 par PIC a généré les mêmes résultats que DIMPLOT (Tableau S4), indiquant que les interactions hydrophobes étaient prédominantes. De plus, l'analyse PIC a montré que E66 et H80 de nsp10 formaient des interactions ioniques avec K38 et D102 de nsp16, respectivement. De plus, pour effectuer une analyse comparative, les tracés cartographiques 2D des interactions de résidus pour le complexe nsp16-nsp10 dans d'autres CoV (SRAS-CoV, MERS-CoV et HCoV-OC43) ont été générés, et les résultats sont représentés sur les Fig. S15–S17.

Selon les résultats DIMPLOT pour le complexe SARS-CoV-2 nsp14-nsp10 (Fig. S14b), les interactions des résidus étaient principalement hydrophobes aux interfaces protéine-protéine, similaires à ce qui a été observé pour le complexe nsp16-nsp10. L'analyse des liaisons H a révélé que K43 et L45 de nsp10 formaient des liaisons H avec le C39 de nsp14. D'autres liaisons H ont été trouvées entre T5, E6 et S15 de nsp10 et S28, T5 et F60 de nsp14, respectivement. K93 de nsp10 a contribué aux interactions avec D126 et T127 de nsp14 via deux liaisons H. De plus, des liaisons H ont été formées entre N40, G94 et Y96 de nsp10 et H29, K47 et D41 de nsp14, respectivement. De même, les résultats de DIMPLOT et PIC étaient dans la même ligne pour le complexe nsp14-nsp10. De plus, d'autres types d'interactions, à savoir ionique, aromatique-soufre, aromatique-aromatique et cation-pi, ont été prédites par PIC pour le complexe nsp14-nsp10 (tableau S4). Les différences dans les interactions du SRAS-CoV-2 nsp10 avec nsp16 et nsp14 résidaient principalement dans les interactions des résidus à l'extrémité N-terminale de nsp10 avec nsp14, les interactions comme les liaisons H entre A1, A18, F19, V21 et D29 de nsp10 et K9, K196, I201, I201 et Y69 de nsp14, respectivement. De plus, N3 de nsp10 a formé deux liaisons H avec D10 de nsp14.

Les contacts intermoléculaires avec une distance de coupure de 8 Å ont été analysés à l'aide de COCOMAPS pour représenter les régions nsp16/nsp14 qui sont en contact avec le SARS-CoV-2 nsp10. Dans les cartes de contact à distance (Fig. S18a), les contacts intermoléculaires des deux complexes sont colorés en fonction de la distance croissante. Les paires de résidus de nsp10 et nsp16, y compris Y96-A83, K43-K38, K93-S105, L45-Q87 et G94-D106, présentaient une distance minimale de <2,82 Å. De plus, les paires de résidus comprenant F60-S15, K9-A1 et Y69-D29 de nsp14 et nsp10 ont été observées dans le complexe nsp14-nsp10 avec une distance minimale de <2,64 Å. La carte de contact du complexe nsp14-nsp10 peut indiquer le rôle des résidus interagissant avec nsp10 dans l'activation de l'ExoN nsp14 au N-terminal. Aucun contact intermoléculaire n'a été observé entre nsp10 et le C-terminal de nsp14. La nature physico-chimique des interactions est indiquée par les cartes de contact de propriété (Fig. S18b). Comme expliqué dans les cartes de propriétés, les interactions hydrophobes ont contribué plus que les interactions hydrophiles pour les deux complexes. Ces résultats étaient en bon accord avec les résultats DIMPLOT et PIC. De plus, COCOMAPS a montré qu'une grande surface d'environ 1852,3 Å2 a été enterrée lors de la formation du complexe SARS-CoV-2 nsp16-nsp10, et sa grande surface d'interface était d'environ 926,75 Å2. De même, la zone enterrée et la zone d'interface du SARS-CoV-2 nsp14-nsp10 lors de la formation du complexe étaient toutes deux importantes, mesurant respectivement 4358,47 et 2180,15 Å2.

Ensuite, les énergies d'interaction résidu-résidu (IE) des complexes SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 et nsp14-nsp10 ont été analysées à l'aide d'INTAA. Selon les résultats, D106 de nsp10 et D125 de nsp16 ont montré les IE nets les plus négatifs (- 190,6 et - 518,33 kJ/mol, respectivement). Parmi les résidus d'interaction clés prédits, E66, Y96 et S72 de nsp10 ainsi que D106, D108 et S105 de nsp16 ont montré les IE nets les plus négatifs. La figure S19 montre une carte thermique pour les IE par paires résidu-résidu entre les résidus d'interaction clés prédits de nsp10 et nsp16. Les EI par paires les plus négatifs avec des rôles stabilisateurs dans les IPP comprenaient les interactions entre K93 et ​​D106, K93 et ​​S105, A71 et D106, G94 et D106 de nsp10 et nsp16, respectivement. Comme mentionné ci-dessus, les distances de la paire de résidus, y compris K93 et ​​S105, ainsi que G94 et D106, ont été prédites parmi les distances minimales à l'étape précédente par COCOMAPS. L'analyse des IE du complexe nsp14-nsp10 a révélé que E6 de nsp10 et E284 de nsp14 présentaient les IE nets les plus négatifs (- 504, 75 et - 296, 05 kJ / mol, respectivement). E6, D29, K25 et D22 de nsp10 et D10, D126, E2 et F60 de nsp14 ont montré les IE nets les plus négatifs parmi les résidus d'interaction clés prédits dans le complexe nsp14-nsp10. Les interactions entre D29 et Y69, S15 et F60, F19 et K200, E6 et V4 de nsp10 et nsp14, respectivement, étaient les IE par paires les plus stabilisantes (Fig. S20). Tous ces résidus avec les rôles les plus stabilisants dans les IPP ont été prédits comme les principaux résidus interagissant dans les étapes précédentes.

Des analyses du réseau de contact protéique (PCN) des complexes SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 et nsp14-nsp10 ont été effectuées pour déterminer la signification topologique de chaque résidu en tant que nœud dans le réseau protéine-protéine. Les paramètres de centralité des nœuds des résidus, y compris la centralité de degré (DC), la centralité d'intermédiarité (BC) et la centralité de proximité (CC) des résidus dans le réseau ont été prédits pour les deux complexes (tableau S5). Dans le complexe nsp16-nsp10, G69, G70, Y96, A71 et K95 de nsp10, et V44, A45, V84 et D106 de nsp16 ont montré le DC le plus élevé parmi les résidus clés prédits. Les résultats ont révélé que G69, M44, G70, G94 et K95 de nsp10, et V44, D106, D108, T91 et I40 de nsp16 présentaient le BC le plus élevé parmi les résidus PPI critiques. Des valeurs CC élevées des résidus clés ont été prédites pour M44, G69, V57, K43 et G94 de nsp10, et V44, D106, V84 et A107 de nsp16 (Fig. S21). L'analyse PCN des résidus d'interaction clés prédits de l'interaction nsp14-nsp10 a montré que parmi les résidus d'interaction critiques, G70, Y96, A71, K95 et A20 de nsp10, et K9, D10, I55 et T131 de nsp14 ont montré un DC élevé. Notamment, G70, A71, K95 et Y96 devaient également avoir un DC élevé dans le complexe nsp16-nsp10, indiquant que ces réseaux étaient communs dans les deux complexes. De plus, F19, S15, A20, A18 et V21 de nsp10 et G59, F60 et Y69 de nsp14 ont montré le CC le plus élevé parmi les résidus clés. Des valeurs BC élevées des résidus clés ont été prédites pour T5, A18, C79, A20 et F19 de nsp10, et G6, T25, G59, Y69 et F60 de nsp14 (Fig. S22). Les réseaux 3D des complexes nsp16-nsp10 et nsp14-nsp10 et leurs interfaces mises en évidence sont illustrés à la Fig. S23.

Pour étudier la stabilité, les fluctuations des résidus et le comportement dynamique des protéines, des simulations MD de 100 ns des composants de coiffage et de relecture du SRAS-CoV-2 ont été analysées. Les RMSD des dorsales, comme l'un des critères de stabilité structurale lors des simulations, ont été calculés par rapport à la structure de référence. Comme l'implique la figure 3a, les RMSD des structures ont eu une augmentation initiale, ont augmenté au cours des 45 premières ns, puis sont restées stables. Ces résultats ont indiqué que les changements conformationnels étaient mineurs et que la liaison nsp14 et nsp10 était stable. Nsp14 avait des valeurs RMSD plus élevées que nsp10, indiquant qu'il était plus flexible sous forme libre. Pour analyser les fluctuations des résidus, les RMSF des atomes Cα ont été calculés. Des valeurs plus élevées de RMSF dans nsp10 ont été observées principalement dans la boucle N-terminale (A1-V7), l'hélice H1 (S11-F19) et dans la région de la bobine et du brin (V42-T47) (Fig. 3b). Des fluctuations plus élevées de l'hélice H1 dans nsp10 peuvent être considérées comme une indication de son rôle dans l'activation de nsp14 ExoN. Dans la structure nsp14, les régions médiant les interactions avec nsp10 ont montré plus de fluctuations qui étaient situées au niveau du domaine N-terminal de la protéine. Les simulations MD ont montré que deux domaines particuliers de nsp14 étaient connectés via une région charnière. Cette région charnière peut séparer l'activité ExoN et N7-MTas de nsp14. Les RMSD du squelette ont été calculées par rapport à la structure de référence pour le complexe nsp16-nsp10 ainsi que les formes libres des protéines nsp16 et nsp10 (Fig. 3a). Les valeurs RMSD étaient relativement stables après 30 ns. Les valeurs moyennes de RMSD pour nsp16-nsp10, nsp16 et nsp10 étaient de 3,6, 2,4 et 2,05 Å, respectivement. Ensuite, les valeurs RMSF pour le complexe nsp16-nsp10, les protéines nsp16 et nsp10 ont été calculées (Fig. 3b).

Graphiques RMSD et RMSF pour les complexes SARS-CoV-2 nsp14-nsp10 et nsp16-nsp10 pendant 100 ns de simulations MD. (a) Graphique RMSD pour nsp14-nsp10, nsp14, nsp10, nsp16-nsp10 et nsp16, et (b) Graphiques RMSF pour nsp10, nsp14, nsp14-nsp10, nsp16 et nsp16-nsp10.

Les résultats de l'analyse des IPP établissent un contexte approprié pour la conception de médicaments. Les résultats des analyses susmentionnées nous ont incités à concevoir des inhibiteurs peptidiques en ciblant les interactions étudiées pour perturber les mécanismes de plafonnement et de relecture du SRAS-CoV-2. À cette fin, dans une première approche, compte tenu des interfaces protéine-protéine partagées prédites des interactions nsp16-nsp10 et nsp14-nsp10 (Fig. 2c), les peptides inhibiteurs ciblant à la fois le SARS-CoV-2 nsp16 2′O-MTase et nsp14 ExoN ont été conçus manuellement. Un ensemble d'inhibiteurs peptidiques à double cible (19 peptides), ci-après dénommés peptides se chevauchant (OLP) avec des longueurs allant de 4 à 8 (tableau S6), a été conçu sur la base des résidus d'interaction clés qui se chevauchent prédits de nsp10 dans SAR-CoV-2, c'est-à-dire T39-T47, G69-S72, C77-H80 et K93-Y96. Pendant ce temps, dans une approche parallèle, quatre ensembles de peptides sous forme de segments chauds avec les énergies de liaison significatives ont été prédits individuellement pour chaque complexe à l'aide du serveur Peptiderive. Au total, 22 peptides linéaires (P-16-5 à P-16-15 et P-14-5 à P-14-15) (tableau S7) et 16 peptides cycliques (tableau S8) avec les scores d'interface relatifs les plus élevés (pourcentage) ont été conçus. Il est remarquable que la comparaison des peptides conçus par les deux méthodologies ait révélé cinq séquences peptidiques similaires. Les OLP, y compris OLP-11, OLP-13, OLP-16, OLP-18 et OLP-19, et les peptides conçus par Peptiderive pour cibler nsp16, y compris P-16-5, P-16-6, P-16-7, P-16-8 et P-16-9, ont les mêmes séquences. Il est important de noter que seuls les peptides linéaires ont été pris en compte dans cette étude et ont été évalués plus avant. Pour évaluer les peptides cycliques prédits, une autre étude de recherche est nécessaire.

L'amarrage moléculaire a été utilisé pour étudier les poses et les énergies de liaison des peptides inhibiteurs conçus avec la protéine cible. La procédure d'amarrage comprenait deux étapes. Dans la première étape, l'amarrage peptide-protéine a été effectué par HPEPDOCK en utilisant son algorithme d'amarrage local et en spécifiant les principaux résidus d'interaction de la cible. Sur la base des meilleurs critères de sélection de modèle, les scores d'énergie d'amarrage des 36 peptides conçus variaient de -152,081 à -49,141 et de -226,821 à -67,438 pour l'amarrage avec nsp16 et nsp14, respectivement (tableaux S6 et S7). Parmi les OLP, OLP-13 lorsque la cible était nsp16 et OLP-18 lorsque la cible était nsp14 ont montré les scores d'énergie d'amarrage les plus bas (-148,518 et -135,334, respectivement). Les OLP avec les scores d'énergie d'amarrage les plus bas pour les deux cibles ont été sélectionnés. Pour la deuxième étape de l'amarrage, 14 des 36 peptides conçus avec les scores d'énergie d'amarrage les plus négatifs, y compris OLP-13, OLP-16, OLP-17, OLP-18, P-16-11, P-16-12, P-16-13, P-16-14, P-16-15, P-14-11, P-14-12, P-14-13, P-14- 14 et P-14-15 ont été sélectionnés.

Les résultats de l'amarrage peptide-protéine par HADDOCK, y compris le score HADDOCK, la RMSD de la structure globale à plus faible énergie, l'énergie de Van der Waals, l'énergie électrostatique, l'énergie de désolvatation et la surface enfouie pour chaque complexe peptide-cible, sont rapportés dans le tableau S9. Tous les peptides étudiés ont interagi avec nsp16 à peu près aux mêmes poses avec lesquelles nsp10 a interagi. Parmi les interactions OLPs-nsp16, OLP-18 et OLP-13 ont montré les scores HADDOCK les plus bas de − 65,8 ± 4,6 et − 50 ± 2,1 avec les grandes surfaces enterrées de 1213,3 ± 29,8 et 950 ± 16,9 Å2, respectivement. P-16-11 et P-16-13 ont montré les scores HADDOCK les plus négatifs parmi les peptides spécifiquement conçus pour cibler le nsp16. Parmi les interactions OLPs-nsp14, OLP-18 et OLP-13 ont montré les scores HADDOCK les plus bas (− 41,1 ± 1,9 et − 39,1 ± 11,3, respectivement). Le score HADDOCK le plus bas (− 99,4 ± 2,5) et la plus grande surface enfouie (1918,3 ± 24,4 Å2) ont été prédits pour le complexe P-14-15-nsp14. Les scores HADDOCK d'amarrage nsp10 avec nsp16 et nsp14 ont été prédits comme référence (-117,1 ± 2 et -123,4 ± 3, respectivement).

À l'étape suivante, le ΔG et le Kd du meilleur modèle de complexe peptide-cible ont été calculés pour chaque peptide (tableau S9). Le ΔG de chaque complexe a été comparé au ΔG de la structure de référence. Les valeurs prédites ΔG et Kd pour le SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 étaient de − 12,8 kcal/mol et 4,3 × 10−10 M, respectivement. Parmi les peptides conçus pour cibler nsp16, P-16-15, P-16-14, P-16-12, OLP-18 et P-16-13, respectivement, ont montré les valeurs ΔG les plus basses (les plus négatives, la meilleure affinité). Les valeurs prédites de ΔG et Kd pour nsp14 étaient de − 21,6 kcal/mol et 1,4 × 10−16 M, respectivement. Les peptides conçus pour cibler nsp14, c'est-à-dire P-14-15, P-14-14, P-14-13, P-14-12 et P-14-11, respectivement, ont montré les valeurs ΔG les plus négatives. Les valeurs ΔG de OLP-13 et OLP-18 pour les interactions avec nsp14 étaient les mêmes (-8,9 kcal/mol). Les peptides conçus avec des valeurs Kd inférieures avaient le potentiel de se lier plus fortement à leur cible protéique respective. De plus, le tableau S9 montre les résultats de l'analyse de décomposition d'énergie libre MM-GBSA des complexes peptide-cible. Les peptides inhibiteurs de nsp16, notamment OLP-18, P-16-12 et P-16-13, ainsi que les inhibiteurs peptidiques de nsp14, notamment P-14-15, P-14-14 et P-14-12, ont montré les énergies libres MM-GBSA les plus négatives, respectivement. La contribution énergétique des peptides conçus par résidu est répertoriée dans le tableau S9. L'énergie de liaison plus faible d'un résidu indique son rôle critique dans l'interaction peptide-cible. Dans OLP-13-nsp16, OLP-13-nsp14, OLP-18-nsp16 et OLP-16-nsp14, la méthionine en position 5 a montré l'énergie la plus faible par rapport aux autres résidus des peptides. En outre, les 10 premiers résidus des protéines cibles avec les énergies les plus faibles sont rapportés dans le tableau S9, et les 5 premiers sont présentés dans les Fig. S24–S27. Dans les interactions OLPs-nsp16, I40, M247, V44 et A83 étaient les résidus communs de nsp16 avec les contributions énergétiques les plus faibles et, par conséquent, les rôles les plus critiques. T25, P24 et F8 de nsp14 étaient des résidus critiques communs (avec les énergies les plus faibles) dans toutes les interactions OLP-nsp14 (tableau S9). Le tableau 2 résume les peptides inhibiteurs conçus, leurs scores d'amarrage prédits et les énergies de liaison.

Après les analyses d'amarrage et d'énergie de liaison des peptides conçus, les interactions des peptides conçus dans le tableau 2 avec la protéine cible ont été analysées pour mieux comprendre les principaux résidus d'interaction et leurs types d'interaction. Les résidus de la protéine cible à l'interface impliquée dans chaque interaction peptide-cible sont répertoriés dans le tableau S9. Les résidus de nsp16, y compris I40, M41, V44, T48, V78, A79, P80, A83, V84, Q87, V104, S105, D106, L244 et M247, étaient des résidus communs impliqués dans toutes les interactions OLP-nsp16. Pour P-16-11, P-16-12, P-16-13, P-16-14 et P-16-15, K38, G39, I40, V44, G77, V78, A79, A83, V84, Q87, V104, S105, D106, L244 et M247 de nsp16 étaient des résidus communs aux interfaces du peptide- complexes nsp16. Les résidus d'interaction communs de nsp14 dans toutes les interactions OLP-nsp14 étaient F8, A23, Q22, P24, T25, D126, T127 et T131. De plus, V4, L7, F8, P20, T21, A23, P24, T25, H26, C39, V40, D41, F60, K61, M62, N63, Y64 et I201 de nsp14 étaient communs pour la médiation des interactions de P-14-11, P-14-12, P14-13, P14-14 et P-14-1 5 avec nsp14.

Les cartes d'interactions pour OLP-13 et OLP-18 avec leurs cibles (nsp16 et nsp14) ont indiqué que les interactions hydrophobes étaient les interactions les plus abondantes dans ces complexes OLP-cible (Fig. 4). Le N1 d'OLP-13 a participé à trois liaisons H avec A79, D106 et V104 de nsp16. De plus, le M5 d'OLP-13 a formé une liaison H avec Q87 de nsp16. Le N1 de OLP-13 a formé deux liaisons H avec T5 et N3 de nsp14. En outre, C2 d'OLP-13 a participé à deux liaisons H avec G6 et L7 de nsp14. D'autres liaisons H ont été trouvées entre K4 et L6 de OLP-13 et T25 et D126 de nsp14, respectivement (Fig. 4a). Le N1 d'OLP-18 a formé trois liaisons H avec A79, G77 et V104 de nsp16. C2 et K4 d'OLP-18 ont participé aux liaisons H avec D106 de nsp16. K4, M5, C7 et T8 d'OLP-18 ont formé des liaisons H avec A83, Q87, L244 et K38 de nsp16, respectivement. Dans l'interaction OLP-18-nsp14, K4 a formé deux liaisons H avec D126 et P24 de nsp14. T8 et C2 étaient impliqués en tant que donneurs dans les liaisons H avec K61 et P20 de nsp14, respectivement (Fig. 4b). Les cartes d'interactions pour les autres peptides sont présentées sur les Fig. S28–S31. Les interactions hydrophobes étaient prédominantes dans ces complexes peptide-protéine. De plus, les fluctuations des résidus dans chaque complexe protéine-peptide cible au cours des simulations sont illustrées à la Fig. S32.

Les cartes des interactions peptide-protéine pour les peptides OLP-13 et OLP-18 et leurs cibles (nsp16 et nsp14). ( a ) Interactions peptide-protéine de l'OLP-13 avec nsp16 (à gauche) et nsp14 (à droite) comme protéines cibles. ( b ) Interactions peptide-protéine de l'OLP-18 avec nsp16 (à gauche) et nsp14 (à droite) comme protéines cibles. Les lignes pointillées noires et les arcs bruns avec des rayons représentent respectivement les liaisons hydrogène et les contacts hydrophobes.

Parmi les peptides conçus, OLP-13, OLP-18, P-16-11, P-16-13, P-14-14 et P-14-15 avec les scores HADDOCK les plus négatifs ont été sélectionnés pour une analyse plus approfondie. (Fig. 5). Ces peptides les mieux notés ont été soumis à une évaluation plus approfondie après des simulations MD de 50 ns à l'aide de la méthode MM-PBSA pour étudier les énergies libres de liaison et sélectionner les peptides les plus prometteurs. Les résultats de MM-PBSA sont présentés dans le tableau 3. Les valeurs négatives de ΔGbinding de MM-PBSA pour tous les peptides analysés ont indiqué leurs affinités de liaison favorables à la ou aux cibles respectives. P-16-11 et P-14-14 ont montré les valeurs de liaison ΔG les plus faibles pour nsp16 et nsp14 (- 30,4218 et - 33,6353 kcal/mol, respectivement). OLP-13 et OLP-18 ont montré une meilleure affinité de liaison, avec une liaison ΔG plus favorable à nsp16 (- 22,4568 et - 24,1671 kcal/mol) qu'à nsp14 (- 17,3694 et - 19,6176 kcal/mol).

Représentations de la structure 3D des meilleurs peptides conçus pour les protéines cibles (nsp16 et nsp14). Les principaux résidus et peptides en interaction sont colorés respectivement en rouge et turquoise.

Après les deux étapes d'amarrage moléculaire puis d'analyse de l'énergie libre de liaison par MM-PBSA, les six peptides les mieux notés (Fig. 5) ont été sélectionnés comme séquences peptidiques principales pour une analyse complète de mutagenèse à saturation in silico afin d'identifier les peptides avec des affinités de liaison améliorées en étudiant les effets de chaque mutation sur l'affinité de liaison peptide-cible conçue. À cet égard, une grande bibliothèque d'inhibiteurs peptidiques avec 1539 nouvelles séquences peptidiques a été générée en mutant chaque résidu de six séquences principales en les 19 autres acides aminés (tableau S10). L'affinité ΔΔGA positive du mutant par rapport au sauvage indique un impact amélioré de cette mutation sur l'affinité peptide-cible. Pour OLP-13 et OLP-18, 17,5 % et 34,8 % des substitutions ont montré une ΔΔGAffinité positive avec des impacts améliorés sur les interactions peptide-nsp16, respectivement. Cependant, seulement 0,06 % et 0,07 % ont montré une affinité ΔΔGA considérable (> 0,5 kcal/mol). Pour les interactions OLP-13-nsp14 et OLP-18-nsp14, 15 % et 40 % des mutations ont montré respectivement des impacts améliorés avec une ΔΔGAffinité positive. La mutation des résidus peptidiques en phénylalanine, tryptophane et tyrosine a montré les impacts d'amélioration les plus élevés de ces variations sur l'affinité peptide-cible avec l'affinité ΔΔGA la plus positive (couleur bleue). Cependant, ces acides aminés ont diminué l'affinité de liaison prédite à certaines positions, comme les substitutions en N1, K4 et M5 d'OLP-13 ou K4 et M5 d'OLP-18 dans l'interaction avec nsp16 (Fig. 6a). La mutation de C2 et K4 d'OLP-13 en complexe avec nsp14 à tous les 19 autres acides aminés a entraîné une ΔΔGAffinité négative (couleurs rouges) avec des impacts décroissants, démontrant les rôles critiques de ces résidus dans l'interaction OLP-13-nsp14 (Fig. 6b). Les cartes thermiques représentant la mutagenèse à saturation in silico d'autres peptides principaux sont présentées à la Fig. S33. De plus, pour obtenir les peptides inhibiteurs optimisés, les propriétés physicochimiques, pharmacocinétiques et de toxicité des peptides conçus ont été prédites. Ces propriétés sont détaillées dans le tableau S11. La prédiction de l'allergénicité a classé les peptides conçus comme des allergènes probables et des non-allergènes probables. De plus, l'analyse de toxicité a classé tous les peptides conçus comme non toxiques, à l'exception de P-16-11, P-16-12 et P-16-13.

Cartes thermiques représentant l'analyse de mutagenèse à saturation in silico des peptides inhibiteurs OLP-13 et OLP-18. (a) interactions OLP-13-nsp16 et OLP-18-nsp16, et (b) interactions OLP-13-nsp14 et OLP-18-nsp14. Les mutations avec des impacts améliorés (ΔΔGAffinity positif) et décroissants (ΔΔGAffinity négatif) sur l'affinité de liaison peptide-cible sont indiquées en bleu et rouge, respectivement.

Pour identifier les inhibiteurs peptidiques du pan-coronavirus, la conservation des résidus cibles qui ont été identifiés pour interagir avec les peptides conçus a été analysée parmi les CoV. L'analyse d'alignement de séquences multiples du nsp16 de sept CoV humains, à savoir SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-NL63, HCoV-229E (Fig. S34a), a révélé que les résidus de nsp16, y compris G39, A79, P80, V84, V104, S105 et D106 qui interagissent avec les peptides, étaient identiques dans ces CoV. I40, M41, T48, G77, V78, A83, Q87, L244 et M247 de nsp16 étaient des résidus similaires. I40 a été remplacé par de la cystéine dans HCoV-OC43 et HCoV-HKU1 nsp16, et par de la valine dans MERS-CoV nsp16. Dans nsp16 du MERS-CoV, M41, T48, V78 et M247 ont été remplacés par l'histidine, la méthionine, l'isoleucine et la leucine, respectivement. Dans HCoV-HKU1, G77 a été remplacé par de l'acide glutamique. A83 a été remplacé par la sérine dans le MERS-CoV et par la thréonine dans le HCoV-NL63. Dans nsp16 de HCoV-NL63 et HCoV-229E, L244 et M247 ont été remplacés par la valine et la leucine, respectivement. Ensuite, la conservation du complexe nsp16-nsp10 parmi quatre CoV (SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV et HCoV-OC43) a été analysée (Tableau S12). G39, T48, V84, S105 et D106 de nsp16 étaient les résidus les plus hautement conservés avec un score de conservation de 9 (magenta foncé). D'autres résidus clés de nsp16, notamment I40, M41, V44, G77, V78, A79, P80, Q87, V104 et L244, étaient bien conservés, avec des scores de conservation de 6 à 8 (rose). Parmi les résidus étudiés, K38 était un résidu très variable avec un score de 1 (turquoise). A83 et M247 de nsp16 étaient conservés de manière intermédiaire ou variables (du blanc au turquoise) (Fig. S34b). L'analyse d'alignement de séquences multiples de nsp14 parmi les sept CoV a montré que L7, F8, P20, A23, V40 et F60 de nsp14 étaient des résidus identiques. V4, Q22, P24, T25, C39, D41, K61, M62, N63, T127 et I201 de nsp14 étaient des résidus similaires (Fig. S35a). L7, P20, A23, T25 et F60 étaient les résidus hautement conservés avec un score de 9 dans le nsp14. F8, C39, V40, D41, K61, M62, N63 et T127 étaient bien conservés (avec des scores de 6 à 8). V4, Q22, P24, H26, Y64, D126, T131, I201, D41 de nsp14 étaient des résidus variables. T21 était un résidu intermédiaire (avec un score de 5) (Fig. S35b ; Tableau S12). En outre, les résultats de l'analyse de conservation de la protéine nsp10 à travers les CoV sont présentés à la Fig. S36 et au Tableau S12.

Dans cette étude, nous avons considéré les IPP dans RTC, en nous concentrant particulièrement sur les rôles de nsp14 et nsp16 et de leur cofacteur critique commun, nsp10. Les interactions de nsp10 avec nsp14 et nsp16 ont démontré son rôle activateur central dans la survie et la pathogenèse des CoV (Fig. 1a). Le ciblage de ces deux IPP est important à plusieurs égards. La grande taille du génome des CoV justifie l'exigence d'une activité ExoN. La capacité de RdRp à sélectionner correctement les nucléotides est insuffisante pour fournir une fidélité de réplication, confirmant l'importance de l'activité de relecture de nsp14 ExoN74. L'interaction de nsp14 avec nsp10 renforce son activité ExoN jusqu'à 35 fois in vitro75. De plus, l'interférence avec la dernière étape du processus de coiffage dans le SRAS-CoV-2 (Fig. 1b) a le potentiel de bloquer les mécanismes de réplication, de traduction et d'échappement viral. Des études ont montré l'inhibition de l'activité enzymatique de nsp16 dans les CoV par des peptides dérivés du nsp10 du SARS-CoV26 et du virus de l'hépatite de la souris (MHV)27.

Pour concevoir les inhibiteurs peptidiques au point de départ du flux de travail (Fig. S3), les résidus clés médiant les interactions de nsp10 avec nsp14 ExoN et nsp16 2'-O-MTase ont été prédits (Fig. 2 et Tableau 1). Tous les résidus d'interaction clés de nsp14 se sont propagés vers son domaine N-terminal ExoN. Cela indique que nsp10 peut ne pas participer à l'activation de la N7-MTase et peut également révéler les rôles distincts des domaines nsp14. Ces résultats étaient en accord avec les études qui ont montré la fonction indépendante de nsp14 ExoN et N7-MTase par l'analyse d'hydrolyse76, ainsi que l'analyse biochimique77. De plus, les résultats des simulations MD ont montré qu'une région charnière séparait les deux domaines de nsp14. En outre, les flexibilités plus élevées de ces régions peuvent refléter leur rôle dans la médiation des IPP. En raison de la nature dynamique de la boucle, les boucles à la fois N-terminal et C-terminal de nsp10 ont montré une plus grande flexibilité par rapport aux autres résidus. Il est important de noter que la comparaison des principaux résidus interagissant dans ces deux IPP a indiqué que 24 résidus dans nsp10 interagissaient avec nsp16 et nsp14 dans le SARS-CoV-2 (Fig. 2c). Les analyses de mutagenèse et de BRET ont également été utilisées pour cartographier les interactions de chevauchement de nsp10 dans le SRAS-CoV78. La caractéristique unique de ces résidus d'interaction clés qui se chevauchent sert de fenêtre pour cibler deux protéines clés (nsp16 et nsp14) avec un inhibiteur (OLP). Bouvet et al.78 ont montré que les mutations K43A et Y96F dans nsp10, nommées « phénotype mutateur », augmentent les mutations du SRAS-CoV. De plus, les mutations nsp10 ont diminué ou mis fin à l'activation d'ExoN75. Les résultats de l'analyse CAS (Fig. S9) sont cohérents avec ces rapports. Des études ont montré que l'inactivation de nsp14 ExoN dans les CoV atténue la fidélité de la réplication jusqu'à 20 fois et que l'absence d'activité ExoN a amélioré la sensibilité à la mutagenèse mortelle en présence de mutagenèse d'ARN79. L'explication des similitudes et des distinctions des résidus interfaciaux et des points chauds entre le SRAS-CoV-2 et les autres CoV (Fig. S6-S8) contribuera à la préparation future d'éventuels nouveaux CoV émergents. De plus, cette étude est la première à avoir prédit les principaux résidus d'interaction (Fig. S8) et leur carte d'interactions (Fig. S17) et a également effectué l'analyse de conservation (Tableau S12) sur la structure récemment rapportée du complexe HCoV-OC43 nsp16-nsp1033.

Les grandes zones d'interface ont été enterrées lors de la formation des complexes nsp14-nsp10 et nsp16-nap10. Par conséquent, ces grandes zones d'interface avec un grand nombre de résidus d'interaction clés ont démontré le ciblage de ces IPP par des peptides interférents au lieu de petites molécules. Les petites molécules ont du mal à participer à ces vastes zones pour concurrencer l'interaction du partenaire d'origine (nsp10). De plus, les cartes des interactions des résidus ont révélé la liaison hydrogène compliquée et les interactions hydrophobes (Fig. S14), ce qui implique que le ciblage de ces interactions hydrophobes avec de petites molécules peut être plus difficile, voire improbable. D'autre part, la taille plus petite des peptides conçus par rapport au nsp10 peut apporter un avantage dans la liaison compétitive en raison d'une concentration effectivement supérieure à l'interface et par conséquent d'une amélioration de leur affinité.

Ensuite, sur la base des résultats de l'analyse des IPP, les inhibiteurs peptidiques ont été conçus par ordinateur pour cibler les mécanismes de coiffage et de relecture de l'ARN dans le SRAS-CoV-2 (tableaux S6 à S8). Ensuite, les peptides conçus ont été évalués (tableau S9). Parmi les OLP, OLP-18 (NCVKMLCT) et OLP-13 (NCVKML) ont montré les scores d'amarrage et les énergies de liaison les plus bas, ont engagé un grand nombre de résidus cibles critiques dans les interactions, ont montré des poses de liaison appropriées et des propriétés acceptables. Les interactions peptide-protéine étaient principalement hydrophobes (Fig. 4), similaires aux interactions natives (Fig. S14). Il n'y avait pas de corrélation générale entre la longueur du peptide et l'énergie libre de liaison pour les peptides conçus lorsque nsp16 était la protéine cible. Cependant, les énergies libres de liaison des peptides lorsque nsp14 était la cible ont montré une corrélation directe avec la longueur du peptide (tableau 2). De plus, les scores HADDOCK de tous les peptides analysés étaient supérieurs à ceux des interactions natives. Ainsi, pour identifier les peptides qui se lient plus fortement avec une liaison ΔG proche ou inférieure à celle du partenaire natif (nsp10), les peptides conçus ont été optimisés par analyse de mutagenèse à saturation in silico et une nouvelle bibliothèque de peptides a été générée (tableau S10). À l'aide de cette analyse mutationnelle computationnelle, les substitutions avec l'affinité ΔΔGA la plus positive ont été révélées (Fig. 6 et S33). Ces mutants, en tant que candidats présélectionnés, lancent une nouvelle série d'études informatiques complémentaires en utilisant les méthodes décrites dans cette étude pour évaluer les peptides nouvellement conçus. De plus, l'analyse de la conservation a révélé la conservation des résidus cibles qui ont interagi avec les peptides conçus (Figs. S34 et S35 ; Tableau S12). Par conséquent, selon la nature conservée des résidus cibles, les peptides conçus ont le potentiel de fonctionner comme des inhibiteurs de pan-coronavirus et peuvent être utiles pour d'éventuels CoV nouvellement apparus. De plus, les peptides cycliques rapportés dans cette étude méritent des recherches informatiques plus poussées.

La S-adénosyl-l-homocystéine en tant que coproduit de la réaction MTase, la sinefungine et l'acide aurintricarboxylique (ATA) ont été identifiés comme des inhibiteurs de liaison au substrat nsp16 des CoV. SAM est utilisé comme donneur de méthyle par diverses MTases cellulaires hôtes. Les inhibiteurs du site de liaison SAM ont un impact sur l'activité 2'-O-MTase de l'hôte, entraînant des effets cytotoxiques induits80. Dans cette étude, le site unique d'interaction virale a été ciblé. Ainsi, les peptides conçus peuvent être plus sélectifs et accomplis que les mimétiques SAM. À notre connaissance, aucun inhibiteur peptidique nsp14 pour les CoV n'est actuellement disponible, et cette étude représente le premier effort de calcul. L'excision de la ribavirine 5'-monophosphate en tant qu'analogue de la guanosine des substrats d'ARN par le complexe nsp14-nsp10 explique sa faible activité contre les CoV. Dans le phénotype mutateur de nsp14 avec inactivation ExoN, la ribavirine a montré 20081 et le remdesivir a montré une sensibilité augmentée de 4,5 fois82. Parallèlement à ces études, la thérapie combinée d'analogues nucléosidiques (AN) avec cette première génération d'inhibiteurs peptidiques conçus par nsp14 est suggérée (Fig. 7). Indépendamment des limites des peptides, cette stratégie proposée mérite d'être explorée. En outre, la thérapie proposée devrait compléter les effets antiviraux des NA et pourrait déclencher une inhibition des mécanismes de réplication et de relecture de l'ARN. De plus, lorsque la résistance au Remdesivir se développe à la suite de mutations RdRp, il est envisagé que les peptides conçus pourraient probablement augmenter l'efficacité du Remdesivir sans augmenter le risque de résistance83. Cependant, certains aspects importants des points de vue moléculaire et biochimique sont encore inconnus, et les peptides conçus nécessitent davantage d'études informatiques et expérimentales. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour étudier les activités des peptides proposés in vitro et in vivo ainsi que pour évaluer leur spécificité, leur efficacité et leur pharmacocinétique. De plus, lors de l'examen des peptides conçus comme agents thérapeutiques potentiels pour les patients atteints de COVID-19, il est suggéré d'étudier leur système d'administration, en particulier les stratégies d'administration préférées, telles que sous-cutanée ou intraveineuse, similaires aux peptides récemment approuvés par la FDA84. De plus, afin d'échapper à l'immunité de l'hôte, les peptides pourraient être générés chez des patients COVID-19 à l'aide d'ARNm85 transcrit in vitro (IVT).

Schéma illustrant la stratégie proposée pour la thérapie combinée d'analogues nucléosidiques (AN) avec les inhibiteurs peptidiques conçus par nsp14 ExoN. La thérapie combinée de la ribavirine, du remdesivir ou d'autres NA avec les inhibiteurs peptidiques nsp14 ExoN conçus dans cette étude est proposée pour compléter les effets antiviraux des NA afin de bloquer à la fois les mécanismes de réplication et de relecture de l'ARN.

Les CoV sont à l'origine de syndromes respiratoires humains depuis de nombreuses années. La pandémie mondiale de COVID-19 a entraîné de nombreuses complications sanitaires et économiques ces dernières années. Cela met en évidence l'importance d'étudier la base structurelle et moléculaire du SRAS-CoV-2 avec un taux d'infection élevé pour le développement de vaccins et de thérapeutiques. Outre la reconnaissance des récepteurs, l'étude de chaque point du RTC et remarquablement des IPP des nsps conduit à la conception d'antiviraux interférents spécifiques, comme les inhibiteurs peptidiques, avec le potentiel de cibler un site d'interaction virale unique. Le chevauchement des interfaces protéine-protéine entre nsp16-nsp10 avec une activité de coiffage et nsp14-nsp10 en tant que gardien de la réplication avec une activité de relecture fait de ces IPP des cibles prometteuses pour la conception d'antiviraux pour les CoV. La perturbation de l'étape de formation du cap-1 du SRAS-CoV-2 a le potentiel de perturber l'activité de la 2′-O-MTase et peut-être de rendre les ARNm viraux plus susceptibles d'être influencés par des capteurs de protéines clés pour initier les premières réponses immunitaires contre l'infection virale. Les capteurs cellulaires, tels que les récepteurs de type péage (TLR), le gène I inductible par l'acide rétinoïque (RIG-I) et la protéine 5 associée à la différenciation du mélanome (MDA5) reconnaissent les ARN dépourvus de 2'O-méthyl au premier nucléotide et induisent des cascades de signalisation qui entraînent l'expression et la libération de cytokines et d'interféron de type I16. Cette étude fournit des informations complètes sur les principaux résidus médiant les interactions de nsp10 en tant que double cofacteur avec nsp16 2′O-MTase et nsp14 ExoN dans le SRAS-CoV-2 et d'autres CoV, qui sont utiles pour concevoir de nouvelles thérapies pour combattre les CoV actuels ou futurs. Les résultats des PPI ont montré que 24 résidus en interaction sont communs aux interfaces PPI de ces complexes. Ainsi, des OLP à double pouvoir inhibiteur ont été conçus, évalués puis optimisés. La conservation prévue des résidus clés cibles offre une nouvelle direction pour la conception d'inhibiteurs pan-coronavirus. Les efforts pour développer et optimiser avec succès les peptides de l'étude actuelle pourraient les transformer en une nouvelle génération de candidats antiviraux pour le traitement du COVID-19 ou de futures épidémies apparentées.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'informations complémentaires.

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Les figures ont été créées avec BioRender (https://biorender.com/). Les figures 1a et 7 ont été adaptées de « Model of Putative Coronavirus Replisome » et « Remdesivir : Potential Repurposed Drug Candidate for COVID-19 (Portrait) », respectivement par BioRender.com (2022). Extrait de https://app.biorender.com/biorender-templates.

Département de biologie cellulaire et moléculaire et de microbiologie, Faculté des sciences et technologies biologiques, Université d'Ispahan, Isfahan, Iran

Fatemeh Arabi‐Jeshvaghani, Fatemeh Javadi‐Zarnaghi & Mohamad Reza Ganjalikhany

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FA, FJ et MRG ont conçu l'étude. FA a collecté les données. FA, FJ et MRG ont analysé et discuté les résultats. FA a écrit le manuscrit. FJ et MRG ont examiné et révisé le manuscrit.

Correspondance à Fatemeh Javadi-Zarnaghi ou Mohamad Reza Ganjalikhany.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Arabi-Jeshvaghani, F., Javadi-Zarnaghi, F. & Ganjalikhany, MR Analyse des interactions protéine-protéine critiques des machines moléculaires de coiffage et de relecture du SRAS-CoV-2 en vue de la conception de peptides inhibiteurs à double cible. Sci Rep 13, 350 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26778-8

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Reçu : 07 août 2022

Accepté : 20 décembre 2022

Publié: 07 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-26778-8

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