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Jan 06, 2024

Une analyse complète des particules de méloxicam produites par ablation laser nanoseconde en tant que technique de broyage humide

Rapports scientifiques volume 12,

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 12551 (2022) Citer cet article

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Récemment, le nombre de composés médicamenteux insolubles et faiblement solubles dans l'eau a considérablement augmenté. Par conséquent, un intérêt croissant a été observé pour différentes techniques de réduction de la taille des particules afin d'améliorer les taux de dissolution, les caractéristiques de transport et la biodisponibilité des médicaments. L'ablation au laser s'est avérée être une méthode alternative à la production de particules de médicament de taille nanométrique et micrométrique sans dommages chimiques considérables. Nous présentons l'ablation laser nanoseconde de pastilles médicamenteuses dans de l'eau distillée, ciblant le méloxicam, un anti-inflammatoire non stéroïdien peu soluble dans l'eau, à différentes longueurs d'onde laser (248 nm, 532 nm et 1064 nm). Outre la caractérisation chimique, la cristallinité, la morphologie et les études de taille des particules, le mécanisme du processus de génération des particules a été examiné. L'applicabilité des particules ablatées dans la formulation de médicaments a été étudiée par des mesures de solubilité, de cytotoxicité et d'effet anti-inflammatoire. Nous avons montré que l'ablation au laser est une méthode propre, efficace et chimiquement non dommageable pour réduire la taille des particules de méloxicam dans la plage de taille inférieure au micromètre à quelques micromètres, ce qui est optimal pour l'administration pulmonaire de médicaments. Complétée par l'excellente solubilité (quatre à neuf fois supérieure) et les propriétés anti-inflammatoires (quatre à cinq fois meilleures) des particules par rapport au médicament initial, l'ablation au laser devrait avoir des applications plus larges dans le développement de formulations de médicaments.

La solubilité est une préoccupation croissante pour l'industrie pharmaceutique car les médicaments peu solubles représentent environ 40 % des composés commercialisés et 90 % des composés candidats1. Cette tendance a inspiré le développement de diverses stratégies de formulation et d'administration de médicaments2. L'une des méthodes physiques les plus simples pour augmenter la solubilité et la biodisponibilité est la réduction de la taille des particules3,4, dont les techniques peuvent être classées5 comme a) conventionnelles : broyage6,7, séchage par atomisation8, homogénéisation à haute pression7 ou b) non conventionnelles : cristallisation anti-solvant liquide9, lyophilisation par atomisation10, procédés de micronisation à base de fluide supercritique11 et ablation au laser pulsé12,13,14,15.

L'ablation au laser pulsé est une technique de traitement de matériaux flexible qui peut être utilisée sous vide, gaz ou liquide avec divers matériaux cibles. Il est largement appliqué pour synthétiser différents nanomatériaux16,17,18,19. Étant donné que l'ablation au laser est une technique sans produits chimiques qui peut être contrôlée avec précision sur une large gamme de paramètres, elle est également devenue attrayante pour les sciences de la vie. Il a été démontré que les particules de médicament pouvaient être déchiquetées par ablation au laser, réduisant ainsi la taille des particules d'origine (synthétisées) jusqu'à l'ordre du nanomètre au micromètre12,13,14,15.

Le présent travail complète notre enquête précédente sur la production de suspension de méloxicam à l'aide de l'ablation au laser pulsé dans un liquide (PLAL)12. Trois longueurs d'onde laser différentes ont été utilisées, et outre la structure et la composition des particules ablatées, leur solubilité, leur cytotoxicité et leur activité anti-inflammatoire ont été étudiées et comparées au médicament d'origine. Pour comprendre le processus sous-jacent, nous avons suivi l'ablation des pastilles médicamenteuses par photographie rapide.

Le méloxicam (Mx.) (4-hydroxy-2-méthyl-N-(5-méthyl-2-thiazolyl) 2H-benzothiazine-3-car-boxamide-1,1-dioxyde) a été obtenu auprès d'EGIS Ltd., (Budapest, Hongrie) sous forme de poudre cristalline à 100 % avec une qualité pharmaceutique supérieure à 99 % et une granulométrie médiane de d (0,5) = 27,52 µm.

Des cibles de méloxicam pur ont été produites en comprimant 300 mg de poudre de méloxicam en pastilles d'un diamètre de 9 mm en utilisant une force de compactage de 15 kN dans une presse à comprimés KORSCH EK-0 (KORSCH AG - Berlin, Allemagne).

Un laser excimère KrF (LLG Twinamp, λ = 248 nm, FWHM = 18 ns, f = 10 Hz) et un laser Nd:YAG Q-switched à fréquence doublée (Quantel, λ = 532 nm/1064 nm, FWHM = 6 ns, f = 10 Hz) ont fourni les impulsions nanosecondes à trois longueurs d'onde allant de l'ultraviolet au visible jusqu'à l'infrarouge.

La configuration était la même pour les trois longueurs d'onde (Fig. 1) : le faisceau laser était transmis à travers une lentille en silice fondue et focalisé juste en dessous de la surface de la cible placée dans un bécher en verre rotatif contenant 10 ml d'eau distillée. La surface cible était à environ 5 mm sous le niveau de l'eau. La taille du spot était d'environ 0,6 mm2 et l'énergie d'impulsion était d'environ 60 mJ à λ = 532 nm/1064 nm, et d'environ 0,3 mm2 et d'environ 30 mJ à λ = 248 nm, respectivement. La fluence d'ablation était de 9,4 J/cm2 dans tous les cas, et selon la quantité de particules ablatées requises pour une mesure particulière, environ 36 000 ou 72 000 impulsions laser ont été utilisées. Après ablation, la suspension résultante a été filtrée à travers un tamis (taille de pores de 300 um) pour éliminer les morceaux de pastilles en flocons afin qu'ils ne faussent pas l'analyse des particules ablatées au laser.

Dispositif expérimental d'ablation par laser pulsé en milieu liquide (PLAL).

La teneur en eau de la suspension a été évaporée à 50 ° C dans un four de laboratoire (CARBOLITE 2416, Thermal Engineering Services Ltd., Worcester, Angleterre) en 12 h, et la poudre restante a été utilisée pour la préparation des échantillons FTIR. Quelques mg des particules séchées ont été mélangés avec 150 mg de KBr, et ce mélange a été broyé dans un mortier d'achat et pressé en un disque d'un diamètre de 13 mm à 10 kN pour analyse FTIR.

Les spectres FTIR ont été enregistrés avec un spectromètre FTIR AVATAR 330 (Thermo Nicolet, LabX Midland, ON, Canada) entre 4000 et 400 cm-1, avec une résolution de 4 cm-1 et une moyenne de 128 balayages/mesures en utilisant la correction de la ligne de base.

Pour les études de spectroscopie Raman, une petite quantité de la même poudre séchée a été utilisée que pour les mesures FTIR. Le microscope Raman Thermo Scientific™ DXR™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, États-Unis) a fonctionné à une longueur d'onde laser de λ = 780 nm pour une excitation à une puissance laser de 2 mW et avec une taille de spot d'environ 3,1 µm. Les spectres Raman ont été enregistrés dans la gamme de nombres d'onde 2500 et 500 cm-1 en utilisant un réseau de 400 lignes/mm. La résolution était de 4,7 à 8,7 cm-1. Tous les spectres ont été enregistrés 20 fois avec un temps d'intégration de 2 s.

HPLC-MS a été utilisé pour la séparation et l'identification des produits d'ablation. Après ablation, la suspension résultante a été concentrée à 1–2 ml par évaporation dans un four de laboratoire à 50 °C. Ensuite, les particules solides ont été dissoutes en ajoutant 5 ml d'acétonitrile. Avant l'analyse HPLC-MS, chaque échantillon a été filtré à travers un filtre seringue (diamètre moyen des pores : 0,22 µm).

Le système HPLC Agilent 1100 était équipé d'un détecteur à barrette de diodes (DAD) et d'un spectromètre de masse Agilent LC/MSD/VL (MS) (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). La séparation a été réalisée à l'aide d'une colonne Kinetex 2,6u XB-C18 100A (Phenomenex), thermostatée à 35°C. L'éluant consistait en 40 % v/v de méthanol et 60 % v/v d'eau avec de l'acide formique (0,1 % v/v) (débit 0,80 ml min-1). Les longueurs d'onde de détection étaient de 210 nm et 350 nm. Les mesures MS ont été effectuées en utilisant l'ionisation par électropulvérisation (ESI) en mode ion positif, un gaz de séchage à l'azote de 300 ° C, une tension capillaire de 3500 V et une tension de fragmenteur de 50 V ont été appliquées. La concentration de méloxicam des suspensions a été déterminée par HPLC-MS, en utilisant la courbe d'étalonnage. La courbe d'étalonnage de premier ordre (R2 = 0,991) a été déterminée avec des solutions de méloxicam pur dans la plage de 50 à 500 mg/dm3.

Pour les études de cristallinité, nous avons utilisé la poudre obtenue à partir de la suspension après séchage à 50 ° C pendant 12 h. Nous avons utilisé un diffractomètre à poudre de rayons X BRUKER D8 Advance (Bruker AXS GmbH, Karlsruhe, Allemagne) avec un rayonnement Cu K λI (λ = 1,5406 Å) et un détecteur VÅNTEC-1, balayant les échantillons à 40 kV et 40 mA, avec une plage angulaire 2θ de 3° à 40°, à une vitesse de balayage de 0,1 s/pas et une taille de pas de 0,0 074°.

La morphologie et la taille des particules ont été étudiées par microscopie électronique à balayage (MEB). Après ablation, une goutte de la suspension agitée a été déposée sur une plaque de silicium. Avant l'imagerie, la gouttelette a été séchée puis recouverte d'or à l'aide d'un vaporisateur (Bio-Rad SC 502, VG ​​Microtech, Uckfield, Royaume-Uni). Les études SEM ont été réalisées avec un système SEM Hitachi S-4700 (Hitachi S4700, Hitachi Scientific Ltd., Tokyo, Japon).

Pour décrire le processus de génération de particules, nous avons construit un système pompe-sonde adapté à la photographie rapide (Fig. 2).

Configuration pompe-sonde pour une photographie rapide avec éclairage direct de la sonde (ligne pointillée bleue) ou étendue avec un interféromètre de Michelson pour une double exposition avec deux impulsions de sonde.

Les images SEM impliquaient que le processus de fabrication des particules était indépendant de la longueur d'onde d'ablation. Pour les investigations, un laser Nd:YAG (Quantel, λ = 532 nm/1064 nm, FWHM = 6 ns) a été choisi comme source de pompe (ablation). À λ = 532 nm, la taille du spot était d'environ 0,2 à 0,3 mm2 et les énergies d'impulsion étaient d'environ 6 à 8 mJ et d'environ 12 à 16 mJ, ce qui a donné des fluences F = 3 J/cm2 et F = 6 J/cm2, respectivement. À λ = 1064 nm, la taille du spot était d'environ 0, 07 à 0, 09 mm2 et l'énergie d'impulsion était d'environ 15 mJ, ce qui a donné une fluence F = 18 J / cm2. (La taille du spot a été réduite par rapport aux expériences de génération d'échantillons afin de s'adapter au champ de vision.) Comme faisceau de sonde, un laser à colorant Rhodamine 6G induit par laser à l'azote a été utilisé (λ = 590 nm, FWHM = 1 ns). Le faisceau laser de la sonde a été transporté vers la configuration d'ablation par une fibre optique et transmis soit directement à la cible, soit via un interféromètre de Michelson qui a fourni deux impulsions de sonde consécutives avec une séparation temporelle de 8 ns. L'éclairage direct a été utilisé pour étudier l'évolution temporelle de la génération de particules, tandis que le but de l'utilisation de deux impulsions de sonde était d'étudier la partie transitoire initiale du processus d'ablation. Le délai entre la pompe et la première impulsion de la sonde a été contrôlé à l'aide d'une photodiode. Les impulsions de la pompe frappent la cible par le haut, tandis que les impulsions de la sonde fournissent un éclairage latéral (tangentiel à la surface éclairée), projetant une image fantôme du processus d'ablation sur une caméra CCD (The Imaging Source-DMK 23G445, 30 ips, N = 3 ×). La lumière du plasma généré a été filtrée par un filtre optique passe-bande placé devant la caméra. Le déclenchement séparé des lasers de la pompe et de la sonde et de la caméra CCD avec des retards de l'ordre de la nanoseconde à la milliseconde a été contrôlé par un générateur de retard numérique (DDG) (Stanford Research Systems-DG645).

Les mesures de solubilité ont été effectuées à température ambiante (22 °C), sur une période de 24 h, dans 10 ml de solution tampon phosphate (pH = 7,4), à l'aide d'une sonde AvaSpec-2048L et d'un spectrophotomètre AvaLight DH-S-BAL (Avantes, Apeldoorn, Pays-Bas). Chaque solution d'échantillon a été filtrée (diamètre moyen des pores du filtre : 0,45 µm), et après la dilution requise, l'absorbance a été mesurée à À = 362 nm et la concentration de méloxicam a été calculée.

Une fois les suspensions séchées (50 °C, 12 h), 1 mg du résidu solide a été remis en suspension dans 1 ml de milieu essentiel minimum Eagle aux sels d'Earle (Sigma, St Louis, MO, USA), additionné de 10 % vol/vol de sérum de veau fœtal, 0,5 % poids/vol de glucose, 0,3 mg de l-glutamine ml-1, 4 mM HEPES et 25 µg de gentamycine ml-1.

Pour caractériser la viabilité cellulaire, l'activité mitochondriale a été mesurée à l'aide d'un test MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium). Au cours de ces expériences, des A549 (cellules épithéliales basales alvéolaires humaines adénocarcinomiques) (ATCC) ont été utilisées et ensemencées à une densité de 4∙104 cellules/puits. Les cellules ont été traitées avec un échantillon contenant des particules produites par ablation laser de pastilles de méloxicam à des longueurs d'onde de 248, 532 ou 1064 nm. Une dilution en série de deux fois des composés a été préparée avec une concentration maximale de composé de 1 mg/ml, et la cytotoxicité a été déterminée avec un temps d'incubation de 24 h à 37 °C. À l'étape suivante, 20 μl de bromure de bleu de thiazolyle et de tétrazolium (MTT; Sigma, St. Louis, Missouri, États-Unis) ont été ajoutés à chaque puits. Après une incubation supplémentaire pendant 4 h à 37 ° C, une solution de dodécylsulfate de sodium (Sigma, St. Louis, Missouri, États-Unis) (10% dans HCl 0, 01 M) a été ajoutée et incubée pendant la nuit. Enfin, la cytotoxicité a été déterminée par des mesures de densité optique (DO) à 550 nm (référence : 630 nm) à l'aide d'un lecteur ELISA EZ READ 400 (Biochrom, Cambridge, Royaume-Uni). A chaque concentration, le test a été répété quatre fois. La viabilité cellulaire a été conclue sur la base de la formule suivante : \({1}00 - \left( {\left( {{\text{OD}}_{{{\text{sample}}}} - {\text{OD}}_{{{\text{medium}}\;{\text{ control}}}} \right) / \left( {{\text{OD}}_{{{\text{cell }}\;{\text{control}}}} - {\text{ OD}}_{{{\text{moyen}}\ ;{\text{ contrôle}}}} } \right)} \right) \times {1}00\) .

Pour observer l'effet anti-inflammatoire, des cellules A549 ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits à une densité de 1∙106 cellules/puits et traitées avec un mélange de 5 µg/ml de lipopolysaccharide (LPS ; ThermoFisher Scientific Waltham, MA, USA) et les solutions des particules ablatées ou traitées avec 5 µg/ml de LPS (contrôle positif) ou laissées non traitées. La concentration de particules dans les solutions a été choisie pour être la concentration maximale non toxique, qui a été déterminée avec les mesures de cytotoxicité décrites dans la section précédente. Les concentrations non toxiques ont été mesurées à 0,125 mg/ml, 0,016 mg/ml et 0,125 mg/ml pour les particules produites par ablation à 248 nm, 532 nm et 1064 nm, respectivement.

L'ARN a été extrait après 24 h de traitement en utilisant le réactif TRI (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) selon les instructions du fabricant. Après cela, 2 µg d'ARN ont été soumis à une transcription inverse à l'aide de Maxima Reverse Transcriptase conformément au protocole du fabricant, en appliquant des amorces Random Hexamer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis).

Pour la qPCR, un système en temps réel Bio-Rad CFX96 a été utilisé avec le 5 × HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermix (Solis BioDyne, Tartu, Estonie) et les paires d'amorces spécifiques à l'homme répertoriées : IL-6 : 5'-CAGCTATGAACTCCTTCTCCAC-3' et 5'-GCGGCTACATCTTTTGGAATCT -3' ; Actb : 5'-TTCTACAATGAGCTGCGTGTGGCT-3' et 5'-TAGCACAGCCTGGATAGCAACGTA -3' Les amorces ont été conçues avec le logiciel Primer Quest Tool et synthétisées par Integrated DNA Technologies Inc. (Montréal, Québec, Canada). Pour vérifier la spécificité d'amplification, une analyse de la courbe de fusion a été réalisée. Les cycles seuils (Ct) ont été déterminés pour l'IL-6 et l'Actb, et l'expression relative des gènes a été calculée avec la méthode 2-(ΔΔCt). Une analyse unidirectionnelle de la variance avec des mesures répétées (ANOVA RM) et des comparaisons planifiées ont été appliquées pour comparer les différences statistiques dans les valeurs de log2(ΔΔCt) entre les échantillons traités et témoins, comme détaillé précédemment, avec un niveau de signification de P < 0,0520.

Après un traitement de 24 h, le surnageant des cellules a été collecté et la concentration d'IL-6 a été déterminée à l'aide des kits ELISA sandwich IL-6 humains standards Legend Max™ (BioLegend, San Diego, Californie, USA) conformément aux instructions du fabricant. Le surnageant des cellules traitées au LPS a été dilué 10x. Le kit avait une gamme dynamique entre 7,8 et 500 pg/ml. Un lecteur de microplaques Biochrom Anthos 2010 (Biochrom, Cambridge, Royaume-Uni) a été utilisé pour analyser les plaques. Les échantillons ont été dosés en double.

Des études FTIR, Raman et HPLC-MS ont été réalisées pour déterminer la composition chimique des particules produites par ablation laser.

En comparant les régions d'empreintes digitales (1800–400 cm-1), nous avons constaté que les spectres FTIR des particules ablatées étaient identiques au spectre de référence du méloxicam (Mx. réf.) Pour toutes les longueurs d'onde du laser d'ablation (Fig. 3) : les pics caractéristiques apparaissaient aux nombres d'onde attendus et les rapports d'intensité des pics étaient les mêmes.

Région d'empreinte digitale des spectres FTIR des particules préparées par PLAL à différentes longueurs d'onde (248 nm, 532 nm, 1064 nm) et du méloxicam (Mx. réf.). Tous les spectres ont été normalisés au pic à ~ 1550 cm-1.

De même, les spectres Raman des particules générées par PLAL correspondaient au spectre de la poudre de méloxicam initiale (Mx. réf.) Pour toutes les longueurs d'onde appliquées (Fig. 4). Ainsi, les résultats Raman concordaient avec les résultats FTIR.

Spectres Raman des particules préparées par PLAL à différentes longueurs d'onde (248 nm, 532 nm, 1064 nm) et du méloxicam (Mx. réf.). Tous les spectres ont été normalisés au pic à ~ 1530 cm-1.

Nous avons également analysé le matériel ablaté par HPLC-MS pour identifier les produits et leurs quantités relatives.

À toutes les longueurs d'onde, la majeure partie du matériau produit par ablation était du méloxicam. Dans les spectres de masse, outre le méloxicam (C14H13N3O4S2, Fig. 5a), nous avons trouvé le produit C4H6N2S (Fig. 5b), connu sous le nom d'impureté de méloxicam B21,22,23. L'impureté B du méloxicam est une section de la molécule de méloxicam et est classée comme étalon primaire pharmaceutique24,25. Pour les trois longueurs d'onde d'ablation, l'aire du pic de Mx. l'impureté B représentait moins de 5% de la surface du pic du méloxicam (Fig. 5c). De plus, au moins trois produits, vraisemblablement aromatiques, étaient présents avec des surfaces de pic relativement petites.

La structure chimique et la masse ionique de (a) le méloxicam et (b) l'impureté B du méloxicam. (c) Les aires de pic relatives de l'impureté B du méloxicam par rapport au méloxicam [(AreaImpurity/AreaMeloxicam) × 100 %] et (d) les concentrations de méloxicam (déterminées par la méthode HPLC-MS) dans le cas des longueurs d'onde étudiées (248 nm, 532 nm, 1 064 nm ).

Après dissolution de toutes les particules dans les suspensions obtenues par ~ 36 000 impulsions laser à chaque longueur d'onde, la concentration de méloxicam a été mesurée à 203,56 ± 27,30, 246,32 ± 58,57 et 242,92 ± 4,90 mg/dm3 pour les longueurs d'onde laser de 248 nm, 532 nm et 1064 nm, respectivement (Fig. 5d). Ces concentrations montrent que le rendement en méloxicam est du même ordre de grandeur à toutes les longueurs d'onde appliquées.

Nous avons analysé la cristallinité des particules produites par spectroscopie de diffraction des rayons X (Fig. 6). Le modèle XRPD de nos échantillons correspondait aux spectres de la poudre de méloxicam d'origine (réf. Mx.) indiquant que l'ablation n'a pas modifié la structure cristalline. Cela a prouvé que les particules générées par l'ablation au laser avaient approximativement le même indice de cristallinité que la poudre de méloxicam commercialisée.

Spectres XRPD des particules préparées par PLAL à différentes longueurs d'onde (248 nm, 532 nm, 1064 nm) et du méloxicam (Mx. réf.). Les spectres ont été normalisés au pic à 25,94°.

La morphologie et la taille des particules ont été étudiées par SEM, et quelques images typiques sont présentées à la Fig. 7. Les particules générées par PLAL ressemblaient à des morceaux de cristal déchiquetés, ce qui indique que la fragmentation mécanique pourrait être l'effet de réduction de taille pertinent. En cas d'ablation UV (λ = 248 nm), des îlots de matériau recristallisé formaient une structure semblable à un film sur la plaque de silicium.

Images SEM de la poudre de méloxicam disponible dans le commerce (réf. Mx) et des particules générées par PLAL à 248 nm, 532 nm et 1064 nm. Grossissement : (a)–(d) : 500 ; (e)-(h) : 1k ; (i)–(l) : 10 k.

Par rapport à la poudre de méloxicam disponible dans le commerce, une réduction de taille significative a été obtenue à toutes les longueurs d'onde étudiées. La taille des particules ablatées variait de quelques centaines de nanomètres à quelques micromètres. Une analyse quantitative a été réalisée à l'aide du logiciel QuPath-0.3.1. L'évaluation a été difficile car les particules se sont regroupées en tas et se sont chevauchées pendant le séchage des gouttelettes. Par conséquent, les limites des particules ont été déterminées individuellement dans les images SEM. Une zone d'image d'environ 10 mm2 a été analysée au cas où chaque échantillon. À titre indicatif, après avoir déterminé la surface couverte par chaque particule, des cercles de surface égale ont été attribués aux particules décrites dans les images, et le diamètre de chaque cercle a été utilisé comme paramètre caractéristique de la taille des particules lors du traçage du diagramme de distribution de taille (Fig. 8).

Distribution granulométrique des particules générées par ablation laser à des longueurs d'onde de 248 nm, 532 nm et 1064 nm. (Notez les différentes échelles sur l'axe y).

Comme proposé précédemment12, la production de particules de méloxicam par ablation laser pulsée dans un liquide peut être décrite par la séquence d'étapes suivante : 1. l'énergie pulsée est absorbée dans un petit volume de la couche superficielle de la cible ; 2. il y a une élévation intense et rapide de la température, et le méloxicam s'évapore et se décompose dans le volume le plus élevé, entraînant un dégagement de gaz explosif et une expansion du plasma ; 3. des forces de recul apparaissent, qui arrachent des particules partiellement fondues et solides de la surface restante. Si les particules s'accumulent dans le milieu liquide, il existe une possibilité de fragmentation "secondaire", lorsque les particules déjà dispersées sont irradiées par les impulsions laser. Dans notre cas, cet effet pourrait ne pas être significatif en raison de la faible concentration en particules et aussi la fluence n'atteint le seuil d'ablation qu'à proximité du foyer.

La période de temps entre 50 ns et 2 ms après l'impact de l'impulsion laser a été étudiée en utilisant des impulsions de pompe λ = 532 nm et un éclairage direct de la sonde. Pour minimiser la lueur du plasma, nous avons essayé de trouver la fluence la plus faible possible à laquelle la formation de particules peut déjà être observée.

A des fins de démonstration, à 3 J/cm2, seul le front d'onde induit par le plasma en expansion était visible, et il n'y avait pas d'éjection de matière (Fig. 9).

Images de photographie rapide d'ablation par laser pulsé (λ = 532 nm, F = 3 J/cm2) de méloxicam dans de l'eau distillée.

Après avoir évalué les images avec ImageJ, nous avons tracé la distance du front d'onde à la surface au fil du temps (Fig. 10) et ajusté les points de données avec une fonction linéaire. Pour la pente nous avons obtenu v = 1490,0 ± 9,5 m/s, ce qui n'est que légèrement supérieur à la vitesse du son se propageant dans l'eau : vw = 1480 m/s (T = 20 °C), indiquant que les ondes observées étaient plutôt acoustiques que des ondes de choc. Cela signifie que même s'il y avait des ondes de choc initiales induites par le plasma en expansion, elles ont rapidement diminué.

Distance du front d'onde à la surface de la pastille en fonction du temps. Les points de données proviennent des mesures de photographie rapide (λ = 532 nm, F = 3 J/cm2).

Nous avons essayé d'augmenter la durée de vie de l'onde de choc en augmentant la fluence à 6 J/cm2, mais toujours aucune onde de choc n'a été détectée. En revanche, nous avons assisté à une intense éjection de matière.

Nous pouvons distinguer trois étapes principales dans le processus d'ablation par laser pulsé dans l'eau, ce qui est clairement visible sur les images de photographie rapide (Fig. 11). Dans les premières centaines de nanosecondes, un front d'onde se propage dans le milieu (Fig. 11a-c). Le front principal est la somme de nombreuses petites ondes provenant de diverses sources ponctuelles sur la surface cible. On observe également l'interférence de ces ondes et leur diffusion sur certaines particules éjectées. De plus, les modifications de l'indice de réflexion du milieu dues à une augmentation de la température pourraient également contribuer aux franges derrière le front d'onde principal.

Images de photographie rapide de PLAL (λ = 532 nm, F = 6 J/cm2) de méloxicam dans de l'eau distillée. (a)–(c) Formation et propagation du front d'onde ; ( d ) - ( g ) Dynamique de rebond de la bulle de cavitation avec l'augmentation de l'éjection de particules; (h) Désintégration de la bulle de cavitation et libération/dispersion de particules dans l'eau.

La deuxième étape dure de quelques microsecondes à quelques centaines de microsecondes et implique la formation et les changements de taille de la bulle de cavitation (Fig. 11d – g). Ce rebond répété de la bulle de cavitation a été décrit précédemment dans le cadre de la dynamique des bulles pour la formation de nanoparticules métalliques (cuivre) par ablation laser dans un liquide26. Les particules générées se trouvent principalement à l'intérieur de la bulle de cavitation, mais à mesure que la bulle pulse, de plus en plus de particules sont éjectées. De petites bulles de gaz apparaissent et remontent à la surface du liquide seules ou parfois avec des particules attachées. Contrairement à une publication précédente27, la présence de bulles de gaz persistantes n'est pas typique dans notre configuration, peut-être en raison de la plus petite fréquence d'ablation appliquée.

Enfin, dans la troisième étape, après quelques millisecondes, la bulle de cavitation se décompose en bulles plus petites qui remontent à la surface de l'eau et toutes les particules piégées dans la bulle de cavitation sont dispersées dans l'eau (Fig. 11h). Un mécanisme similaire a été présenté pour diverses cibles et liquides28,29,30.

Nous avons optimisé la configuration et les paramètres pour pouvoir détecter les ondes de choc initiales. De la fibre optique, l'impulsion de sonde a été dirigée vers l'interféromètre de Michelson fournissant deux impulsions de sonde avec une séparation temporelle fixe. Cette disposition nous a permis d'estimer plus précisément la vitesse de propagation. Pour éviter tout chevauchement des impulsions laser de pompe et de sonde et pour minimiser la lumière diffusée interférente, le faisceau laser λ = 1064 nm a été appliqué comme pompe. Nous avons augmenté la fluence jusqu'à l'apparition des ondes de choc. L'ablation a rapidement dégradé la surface, nous avons donc dû déplacer la cible entre les tirs d'ablation consécutifs pour fournir une surface fraîche. De plus, la gigue de la synchronisation, la porosité de la cible et la légère variance de l'énergie de l'impulsion laser ont toutes contribué à un certain degré d'incertitude dans l'analyse quantitative.

La figure 12 présente des images prises en utilisant cette configuration optimisée et en capturant les phases initiales de la formation des ondes de choc et l'apparition de la bulle de cavitation. Au fil du temps, en raison du schéma d'imagerie spécifique, il semble que deux fronts d'onde se propagent avec une séparation spatiale décroissante. La bulle de cavitation émerge et grossit.

Images de photographie rapide d'ablation par laser pulsé (λ = 1064 nm, F = 18 J/cm2) de méloxicam dans de l'eau distillée. (a)–(f) Formation et propagation du front d'onde doublement exposé à deux instants avec une séparation temporelle de t = 8 ns ; ( c ) - ( f ) Changements de génération et de taille de la bulle de cavitation.

À l'aide d'ImageJ, la séparation/distance spatiale (x) des fronts d'onde a été mesurée sur chaque image. L'interféromètre de Michelson a introduit une séparation temporelle = 8 ns entre les deux impulsions de sonde. A un instant donné après l'impact de l'impulsion de pompe, en divisant la distance actuelle par l'écart de temps fixe, nous avons pu calculer la vitesse moyenne de propagation du front d'onde entre les deux instants enregistrés avec les impulsions de sonde (Fig. 13). Les points de données montrent que la vitesse de propagation moyenne va au-delà de la vitesse du son dans l'eau (vw) et suit ensuite une tendance décroissante au fil du temps, se rapprochant progressivement de vw = 1480 m/s. Comme l'onde de choc a quitté le champ de vision, nous n'avons pu obtenir aucune donnée de vitesse après un délai de 200 ns où la saturation semble être d'environ 1550 m/s (Fig. 13). Cependant, sur la base des mesures de propagation du front d'onde présentées sur la Fig. 10, on peut supposer qu'au final la saturation se situera autour de vw = 1480 m/s. En conclusion, l'onde de choc initiale devient une onde acoustique en quelques dizaines ou centaines de nanosecondes, selon la fluence appliquée.

Dépendance temporelle de la vitesse de propagation du front d'onde produit par PLAL (λ = 1064 nm, F = 18 J/cm2) de méloxicam dans de l'eau distillée.

Des études de solubilité ont montré qu'une plus grande quantité de méloxicam pouvait être dissoute dans la solution tampon à partir des particules préparées avec la méthode PLAL qu'à partir de la poudre de méloxicam d'origine dans le cas de toutes les longueurs d'onde laser appliquées (Fig. 14).

Données de solubilité du méloxicam disponible dans le commerce (réf. Mx) et des échantillons produits avec différentes longueurs d'onde d'ablation (248 nm, 532 nm, 1064 nm).

Par rapport à la concentration de saturation du méloxicam de référence (0,043 mg/ml), une augmentation de neuf, quatre et huit fois de la concentration de saturation a été mesurée lorsque les particules de méloxicam produites par PLAL à 248 nm, 532 nm et 1064 nm ont été dissoutes. Quantitativement, cela a entraîné des concentrations de saturation de 0,388 ± 0,0605 mg/ml (pour λ = 284 nm), 0,163 ± 0,004 mg/ml (pour λ = 532 nm) et 0,327 ± 0,026 mg/ml (pour λ = 1064 nm).

La limite non toxique a été définie comme la concentration la plus élevée qui assure encore 100 % de viabilité cellulaire. La dose thérapeutique de méloxicam dans les médicaments commercialisés est de 7,5 ou 15,0 mg per os et 1/10 de cette dose est recommandée pour l'administration pulmonaire 31,32, par conséquent une concentration de 1 mg/ml a été choisie comme concentration maximale pour les études de cytotoxicité. Le méloxicam de référence n'a montré aucune toxicité à des concentrations inférieures à 0,125 mg/ml. Les mesures de cytotoxicité ont montré que les échantillons générés par PLAL à λ = 248 nm et 1064 nm n'avaient aucun effet cytotoxique mesurable en dessous de 0,125 mg/ml, alors qu'en cas de λ = 532 nm, la limite non toxique était d'environ 0,016 mg/ml (Fig. 15). Les échantillons produits par PLAL à λ = 248 nm et 1064 nm étaient dans la même plage de cytotoxicité que le méloxicam de référence, tandis que le composé généré à λ = 532 nm était le plus cytotoxique. Ces concentrations non toxiques déterminées ont été utilisées dans les mesures anti-inflammatoires.

Viabilité cellulaire dans le cas des longueurs d'onde d'ablation étudiées (248 nm, 532 nm, 1064 nm).

Pour tester l'effet anti-inflammatoire, le LPS, un puissant agent pro-inflammatoire, a été utilisé pour augmenter la production d'IL-6 des cellules A54933. En mesurant la teneur en IL-6 après traitement avec les échantillons de médicament produits par PLA, nous avons pu décrire et comparer leurs effets anti-inflammatoires. Le LPS ajouté a significativement élevé l'expression relative de l'IL-6 par rapport au groupe non traité. L'expression relative d'IL-6 a quadruplé dans le cas des cellules traitées au LPS (4,2 ± 0,2) par rapport aux cellules non traitées (1,1 ± 0,2). En comparant l'expression relative de l'IL-6 dans les cellules traitées avec LPS + médicament et les cellules traitées avec LPS uniquement, nous avons constaté qu'une diminution modérée (∼25%) pouvait être obtenue en ajoutant les échantillons produits par ablation laser UV (λ = 248 nm) et IR (λ = 1064 nm), et une réduction significative (∼75%) en ajoutant l'échantillon d'ablation laser VIS (λ = 532 nm) (Fig. 16a). Quantitativement, cela a entraîné des expressions relatives de l'IL-6 de 3,1 ± 1,5 pour les UV, 0,8 ± 0,4 pour le VIS et 2,8 ± 1,1 pour l'IR.

( a ) Expression relative et ( b ) concentration d'IL-6 dans le cas de cellules A549 non traitées (non traitées), de cellules A549 traitées au LPS (LPS), de cellules A549 traitées avec du LPS et d'une suspension de méloxicam générée par ablation au laser à des longueurs d'onde respectives (LPS + 248 nm, LPS + 532 nm et LPS + 1064 nm). Dans le cas de la concentration d'IL-6 (b), les données des cellules A549 traitées avec du LPS et une suspension de méloxicam de référence (LPS + Mx. réf.) sont également présentées.

Pour déterminer si ces niveaux d'expression relatifs étaient corrélés avec les niveaux de protéines, des mesures ELISA ont été effectuées pour mesurer les concentrations d'IL-6 dans les surnageants (figure 16b). Dans le groupe non traité, il n'y avait pas de niveau mesurable d'IL-6. Par rapport aux cellules non traitées (0,0 ± 0,0 pg/ml), la concentration d'IL-6 a augmenté de manière significative à la suite du traitement au LPS (jusqu'à 49,4 ± 7,3 pg/ml). Lorsque le méloxicam de référence a été ajouté aux cellules traitées au LPS, la concentration d'IL-6 a diminué de 20 % (à 39,9 ± 2,9 pg/ml) par rapport aux cellules traitées au LPS uniquement. Après le traitement au LPS, l'ajout d'échantillons ablatés au laser a considérablement réduit les concentrations d'IL-6 : de 89 % (à 5,6 ± 2,9 pg/ml), 95 % (à 2,5 ± 0,4 pg/ml) et 78 % (à 10,7 ± 0,8 pg/ml) en utilisant respectivement les lasers UV, VIS et IR. Sur la base de la diminution de la concentration de la cytokine IL-6, tous les échantillons produits par PLA ont montré un effet anti-inflammatoire significatif, beaucoup plus fort que le méloxicam de référence. Selon les mesures, l'échantillon généré à λ = 532 nm avait les meilleures propriétés anti-inflammatoires malgré la dose la plus faible requise sur la base des mesures de cytotoxicité.

L'ablation au laser pulsé du méloxicam dans de l'eau distillée s'est avérée être une technique efficace et sans produits chimiques de réduction de la taille des particules aux trois longueurs d'onde étudiées.

Les études FTIR, spectroscopie Raman et HPLC-MS ont montré que la décomposition chimique était négligeable pendant l'ablation. L'impureté B du méloxicam était présente en quantité relativement faible. Les particules ont conservé leur cristallinité tout au long du processus et leur morphologie ressemblait à celle des cristaux brisés. La taille initiale d'environ 30 µm des particules de méloxicam pourrait être réduite à la plage de taille comprise entre quelques centaines de nanomètres et quelques micromètres, optimale pour l'administration pulmonaire. Une analyse photographique rapide a confirmé que le broyage mécanique est le principal processus conduisant à la réduction de la taille des particules. L'applicabilité pharmaceutique est soutenue par l'augmentation significative (neuf, quatre et huit fois) de la solubilité des échantillons ablatés aux longueurs d'onde d'ablation respectives. Malgré l'effet cytotoxique similaire (∼0,125 mg/ml à λ = 248 et 1064 nm) ou supérieur (∼0,016 mg/ml à λ = 532 nm) des suspensions produites par PLAL, l'effet anti-inflammatoire était excellent (concentration d'IL-6 diminuée de 89, 95, 78 % à λ = 248, 532, 1064 nm, respectivement) et largement supérieur à celui du méloxicam de référence.

Sur la base de la solubilité, de la cytotoxicité et des propriétés anti-inflammatoires obtenues, nous nous attendons à ce que le même effet thérapeutique puisse être obtenu avec une dose de médicament significativement plus faible en utilisant des particules déchiquetées par la technique PLAL.

Par conséquent, les particules de méloxicam générées par ablation au laser pulsé dans de l'eau distillée pourraient convenir à une administration per os ou pulmonaire. Alternativement, le méloxicam en suspension dans l'eau pourrait être transformé en produit intermédiaire solide pour la préparation de différentes formes posologiques (comprimés, gélules ou inhalateurs de poudre sèche, etc.).

Les ensembles de données générés pendant et/ou analysés pendant l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Ce travail a été soutenu par le nouveau programme national d'excellence ÚNKP-21-3-SZTE-446 du ministère de l'Innovation et de la Technologie de la source du Fonds national pour la recherche, le développement et l'innovation. Projet n° TKP2021-EGA-32 a été mis en œuvre avec le soutien du ministère hongrois de l'Innovation et de la Technologie du Fonds national de recherche, de développement et d'innovation, financé dans le cadre du programme de financement TKP2021-EGA-32.

Financement en libre accès fourni par l'Université de Szeged. Le financement a été fourni par le Fonds d'accès ouvert de l'Université de Szeged, numéro de subvention 5722.

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EN a réalisé les expériences d'ablation et les mesures FTIR. EN et Zs.H. étaient responsables des mesures et des calculs photographiques rapides. TS a fourni un support technique. JK et EN ont réalisé, analysé et visualisé des investigations SEM et Raman. MN a effectué, et MN et TA ont analysé les mesures HPLC-MS. DK a réalisé et analysé les études de cytotoxicité et d'anti-inflammatoire sous la supervision de KB. P.Sz.R. et RA ont fourni la XRPD et les mesures de solubilité et ont soutenu le contexte pharmaceutique de l'article. BH a assuré la conceptualisation et la supervision. EN a écrit le texte principal du manuscrit et préparé les figures. Tous les auteurs ont participé à la révision et à l'édition du manuscrit et ont approuvé la version finale pour publication.

Correspondance à Eszter Nagy.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Nagy, E., Homik, Z., Smausz, T. et al. Une analyse complète des particules de méloxicam produites par ablation laser nanoseconde en tant que technique de broyage humide. Sci Rep 12, 12551 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16728-9

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Reçu : 14 avril 2022

Accepté : 14 juillet 2022

Publié: 22 juillet 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-16728-9

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